純水服務于流式細胞技術進行植物生殖細胞學研究

流式細胞術的發展

流式細胞術最初是開發應用于醫學領域的，但是隨后逐漸演變成了細胞計數、分類以及生物標記探測等不同領域內的有利工具[7]。盡管相關的第一篇采用流式細胞術進行植物細胞核分析的文章發表于1973年[8]，但是采用流式細胞術所開展的植物DNA分析在上世紀80年代末才獲得了突飛猛進的發展，從此所有研究人員都開始堅定地在植物研究領域使用該項技術。基本上，植物學家都是使用流式細胞術來測定植物細胞核中的DNA含量。有關流式細胞術詳細的原理及應用的描述，請參閱參考文獻9。

圖2a概括表示了流式細胞儀如何通過電子檢測設備用一束水動力集中的液體流對經染色的或靶向的粒子（尺寸介于0.2μm-150μm[7]）進行懸浮排列。在植物研究中，先用熒光標記物（比如：DAPI[4’,6-二脒基-2-苯基吲哚]或碘化丙啶）對細胞核（比如：粒子）進行染色。然后，每一個懸浮的細胞核暴露于光束（通常為激光或UV燈光）之中，于是光的路徑被分散并由檢測器感知，用于分析每一個單獨粒子的熒光強度，為核酸中DNA含量的測定提供信息。成千上萬個完整細胞核的合并數據可為單獨組織的DNA含量提供信息（參見圖1中的波峰）。由于每一秒鐘幾乎會同時進行分析多達數千個粒子的物理和/或化學特征，因此用于樣品分離和樣品檢測的溶液的質量和純度非常關鍵。

如果使用的是低品質或不合適的水供應系統，則出現的不屬于樣品的污染物顆粒會發生熒光反應并產生“噪聲”，這會干擾檢測結果并導致最終錯誤的評估。因此，實驗時必須要使用高品質的超純水。

超純水系統生產的超純水達到ASTM I級品質

能夠生產出達到ASTM I級品質超純水的超純水系統由賽多利斯（哥廷根，德國）提供。使用arium? pro VF水系統生產的超純水（ArUPH2O）進行流式細胞分析，為了評估超純水對分析結果的質量所產生的影響，作者檢查了兼性孤雌生殖的被子植物用于生產種子的繁殖途徑。這是通過比較分別采用ArUPH2O和標準鞘液溶液（0.04%疊氮化鈉， 0, 01%去污劑）對樣品進行檢測所獲得的結果而實現的（Partec GmbH）。

arium? pro VF系統（圖3）從經過預處理的飲用水中通過去除所有污染微粒而生產出超純水。超純水的生產需要持續循環和一個恒定的水流速率，這可以通過一個帶壓力控制功能的泵系統來實現。在進水端口和下游端口，或者產水端口進行電導率的測定。

本文所描述的測試用arium? pro VF水系統（老一代與當前的新一代arium? pro VF水系統有著完全相同的技術設計，如圖3所示）通過兩支不同的濾芯來工作。這兩支濾芯裝填有特殊的活性炭吸附劑和混床離子交換樹脂，用以生產總有機活性炭（TOC）含量極低的超純水。此外，系統還有一個集成的UV燈，在波長為185nm和254nm時分別具有氧化有機物和殺菌效果。

除此之外，超純水系統有一個內置的作為切向流過濾器使用的超濾模塊。該過濾器中整合的超濾膜可截留膠體、微生物、內毒素、RNA以及DNA等。出水端口安裝有一個0.2μm的終端過濾器，用以去除超純水生產后分配過程中的微粒和細菌。該設備生產純水的工藝流程請參閱圖4。

材料與方法

種子樣品來源于六倍體毛茛屬植物，在自由授粉的條件下進行挑選收集。種子個體在塑料有蓋培養皿內用300μl的提取緩沖液（CyStain UV Precise P, Partec GmbH）進行碾碎，然后在室溫下孵育10分鐘，再將細胞核過濾（30μl漿狀物，CellTric?, Partec GmbH）至一個5-mL的塑料管中。而后，加入1.2mL染色緩沖液（CyStain UV Precise P），60秒后，樣品進入流式細胞儀（CyFlow Space，Partec GmbH；參見圖2b）的藍色熒光通道進行分析。更多內容 ?

結果

總共有61個單獨種子重建了繁殖途徑。根據建議的標準程序，30個種子使用鞘液懸浮，31個種子使用ArUPH2O（電導率： 0.055μs/cm或18.2MΩ×cm電阻補償至25℃）懸浮。平均每個樣品測試了2329個細胞核，占總計數粒子的73%，而其它27%表現為細胞周期G2階段的細胞核或者背景信號。針對所有被分析的種子，全部要根據每個峰所富集的平均總數來計算胚胎和胚乳的平均峰位置。

討論

總之，所獲得的測試結果中具有極小的差異，這證實了arium系統是適用于植物材料相對倍性分析的快速又經濟的極佳選擇。高品質的arium超純水水被證明用于實現流失細胞種子篩選技術上的可重現結果是非常有效的。盡管如此，由于抗生素和去污劑之類的添加劑具有可阻止生物膜的形成，以及增加容器、管道、閥門以及流動腔內表面的濕度等作用，對流失細胞系統的可靠操作會造成長期或短期的正面影響，因此供應商一般會建議在自制的鞘液中添加此類物質。

簡而言之，ArUPH2O可即時用于植物細胞的流式細胞技術。由于流失細胞技術在其它應用中越來越重要，比如腫瘤細胞的檢測，細胞的定量測定與形態分化，細胞周期分析，DNA-RNA含量估算，以及凋亡檢測等等，ArUPH2O的全面適用性為arium超純水在一系列使用流式細胞術的新興技術中的應用創造了新機會。

參考文獻

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