DNA提取純化技術概述

質粒DNA的提取與純化

質粒是一類雙鏈、閉環的DNA，大小范圍從1 kb至200 kb以上不等。通常情況下，質粒可持續穩定地處于染色體外的游離狀態，具有自主復制功能；但在一定條件下也會可逆地整合到宿主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。

質粒已成為核酸克隆和測序最常用的載體。質粒DNA提取的產量和純度直接關系到下游實驗操作的成敗。提取質粒DNA的方法很多，目前應用最為廣泛的是堿裂解－中和法，其基本原理為：當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質與DNA發生變性；當加入中和液后，質粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態，離心時保留在上清液中；蛋白質與染色體DNA不能復性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。

質粒DNA的純化方法通常是利用了質粒DNA相對較小以及共價閉環這兩個性質，例如氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法。但這些方法相對昂貴或費時。對于小量制備的質粒DNA，經過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟即可去除殘余蛋白質和RNA，所得純化的質粒DNA可滿足酶切、轉化、探針標記、測序等要求。然而該方法耗時較長，需要接觸苯酚、氯仿等有毒溶劑，而且所提取的質粒 DNA有時不能被限制性內切酶完全消化，因此在追求效率的今天，這種方法已逐漸被質量可靠、快捷便利的離心吸附柱純化方法所代替。

線性DNA片段的純化

PCR產物或酶促反應的DNA片段中所含的酶、鹽類、殘留引物、dNTP和其他DNA片段有可能影響后續反應的效果，故需經過純化處理。 對于電泳檢測觀察到的單一條帶，可以采用乙醇沉淀回收或單純過柱回收方法；對于有非特異性條帶或其他雜帶的DNA片段，則有必要進行膠回收純化。目前商品化的DNA片段回收試劑盒多采用硅膠基質材料特異性地吸附DNA，通過高鹽/乙醇洗脫，清除雜質。由于各種試劑盒所采用的硅膠基質材料不同，DNA片段的回收效率也存在著很大的差異。

基因組DNA的提取、純化

基因組DNA相對穩定，故其提取方法也相對簡單。通常細胞通過表面活性劑處理，釋放出基因組DNA，經過蛋白酶和RNA酶消化后，經有機溶劑抽提和乙醇沉淀或過柱純化即可獲得一定量的基因組DNA。目前商品化的基因組DNA提取試劑盒分為溶液型和離心吸附柱型兩種。溶液型產品價格經濟，產率高，可獲取適用于建立文庫的高分子量DNA，并且可盡可能地回收稀有樣品中的DNA；但操作過程較為繁瑣，對操作者的實驗技能要求較高。離心吸附柱型產品使用方便、快速，提取的DNA 純度較高，但價格昂貴，產量偏低，并且得到的片段多在20 kb左右，不適合建立DNA文庫或用作長片段PCR產物的模板。