哮喘致敏小鼠模型的建立及脾臟 CD4+T細胞的分離
Establishment of sensitized asthma model in mice and CD4+T lymphocyte isolation from spleens
程曉明,王長征,李淑平,錢桂生(第三軍醫大學附屬新橋醫院全軍呼吸內科研究所,重慶 400037)
提 要 : 目的 建立一種可靠的哮喘致敏小鼠模型及分離脾臟 CD4+T細胞。方法 采用卵蛋白致敏的方法建立模型 ,運用panning法分離 CD4+T細胞。結果 此模型小鼠肺組織呈現典型的哮喘樣病理改變 ,其外周血、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒細胞百分比(EOS%)顯著高于正常對照組( P < 0.01) 。CD4+T細胞純度經流式細胞術(FCM)檢測 ,純度達 97.3 %。結論 此方法建立的模型及分離的 CD4+T細胞可用于哮喘的實驗研究。
建立哮喘動物模型及分離高純度的 CD4+T細胞是實驗研究哮喘發病機制的重要前提。本實驗就小鼠致敏模型的建立及其脾臟 CD4+T細胞的分離方法進行介紹。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及材料
1.1.1 淋巴細胞分離液 將 9 % ficoll 400 溶液(Sigma 公司)和 33.9 %泛影葡胺溶液按比例混合 ,調比重至 1.090。
1.1.2 尼龍毛柱的制備 稱取 80mg 尼龍毛 ,將其細致撕勻后裝入 2 ml 一次性注射器內 ,柱高約 4 cm。用 Hanks 液充分浸濕尼龍毛柱 ,使其內不留氣泡 ,高壓滅菌消毒。使用前用預溫至 37 ℃的 RPMI 1640(含 10 %胎牛血清 ,Fetal calf serum ,FCS)洗柱后封閉下端出口。
1.1.3 CD8+單克隆抗體(Monoclonal antibody ,mAb)包被平皿的制備 取若干個聚苯乙烯平皿 ,將 CD8+mAb 溶液(北京邦定公司)100μl 加入平皿中 ,并加入 0. 05 mol/L 碳酸鹽緩沖液(pH9.5)3 ml ,混勻 ,室溫下無菌放置 40 min ,磷酸鹽緩沖液 (PBS,pH7.2)漂洗 ,加入含 1 % FCS的 PBS,室溫下無菌孵育 15 min ,PBS漂洗 ,4 ℃保存備用。
1.2 實驗動物及分組
4～6 周健康 BALB/ c 小鼠 40 只 ,雌雄不限 ,體重 16～20 g ,由第三軍醫大學實驗動物中心提供。將小鼠隨機分為兩組 ,A組為正常對照組 ,以生理鹽水代替雞卵清蛋白 (Ovalbumin ,OVA , Grade Ⅱ, Sigma 公司) 致敏和激發小鼠 ;B 組為致敏模型組 ,給予 OVA致敏和激發。
1.3 致敏小鼠模型的建立
分別于第 1 天、第 13 天經小鼠腹腔注射 OVA 10μg 和氫氧化鋁凝膠(Al(OH)3)20 mg混合液;第 25 天時 ,將每只小鼠單獨置于 5 L 密閉容器中 ,以 1 % OVA 進行霧化吸入激發 ,使小鼠暴露在 OVA 氣霧中 20～30 min 直至出現哮喘樣發作為止 ,持續 6 d。由 402 型超聲霧化器(上海合力醫用器械廠)提供霧化動力。
1.4 外周血、支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage
fluid ,BALF)中嗜酸性粒細胞百分比 (percentages
of eosinophils ,EOS %)計數及肺組織標本留取
1.4.1 外周血及 BALF中 EOS%計數 各組小鼠各 14 只最
后一次激發 24 h 后 ,經腹腔麻醉 ,行氣管切開 ,收集 BALF 5ml ,
針刺心臟取血約 0. 5～0. 8 ml。將全部液體離心 ,收集沉淀細
胞 ,加入紅細胞裂解液去除紅細胞。用 EOS 計數液行 EOS 計數。