xCELLigence系統持續檢測神經細胞培養
Sebastian Diemert, Julia Grohm, Svenja,Tobaben, Amalia Dolga, Carsten Culmsee
德國，馬爾堡大學，藥理學與臨床藥學研究所
摘要：為了研究類神經元細胞HT-22，及原代培養大鼠皮質神經元細胞對不同細胞死亡刺激物的反應，我們使用由羅氏與ACEA Biosciences公司聯合開發的實時細胞分析儀（Real-Time Cell Analyzers，RTCA）xCELLigence系統，應用非侵入式、無標記性技術，對類神經元細胞HT-22進行持續監測。研究表明，通過對細胞形態學改變、細胞粘附與細胞增殖的監測，xCELLigence系統可對神經細胞培養進行持續監測并追蹤細胞的變化及其死亡情況。
關鍵詞：神經細胞死亡、xCELLigence系統、原代皮質神經元細胞、HT-22 細胞、細胞阻抗、實時測定
前言
在很多神經退化性疾病中發現了神經元凋亡與壞死。近幾年來，神經科學研究中建立了幾種細胞培養模式，用于體外細胞死亡機制的研究。盡管近年來科學界對神經元細胞死亡信號傳導原理已經得了一定成果，但技術上的局限性依然存在，從而限制了對數據的采集與解讀。而無法進行神經細胞死亡的實時監測是一個主要的技術瓶頸。目前為止，主要的細胞增殖、細胞生存與細胞死亡檢測方法均為侵入式終點檢測，通常對細胞有毒性，并需要對細胞進行破壞處理。
同時，對神經細胞死亡與潛在機制進行動態變化分析，需要大量的實驗操作，涵蓋持續的、多個時間點。目前有幾種終點實驗法，可進行特定凋亡時間點上的特異性分子事件的檢測，如磷脂酰絲氨酸轉位至細胞膜外部，線粒體功能障礙、半胱氨酸蛋白酶激活，以及
DNA 斷裂[1]。這些終點測定的一個缺陷是，其無法確定實驗凋亡時間點。為解決這個問題，研究人員需要重復對細胞死亡形態學改變進行監測。
目前，使用由羅氏與 ACEA Biosciences公司聯合開發的實時細胞分析儀（Real-Time Cell
Analyzers，RTCA）xCELLigence系統，應用非侵入式、無標記性技術，可對細胞進行持續監測。xCELLigence系統對將傳感器微電極點陣整合入E-Plate
96培養孔底部，并對生長于上的細胞阻抗進行記錄。阻抗測定記錄的是細胞指數（Cell
Index，CI）值，細胞貼附于電極后，當細胞形態學發生變化，會導致電流環路電阻改變，該電阻與細胞指數具有相關性。通過對細胞形態學改變、細胞粘附與細胞增殖的監測，xCELLigence
系統可追蹤細胞變化與細胞死亡情況。
本研究中，我們使用xCELLigence系統，對類神經元細胞HT-22，及原代培養大鼠皮質神經元細胞，對不同細胞死亡刺激物的反應進行了研究。原代培養神經細胞的一個特征是其濃密的樹突狀網絡，該網絡在凋亡誘導后，可殘留于組織反應板上。無論細胞本身是否已發生凋亡，凋亡神經元可殘留貼附于細胞培養板上，并顯示出一定的阻抗性。這種特性對原代神經元培養監測的影響，也是本次使用RTCA儀器進行研究的一個熱點。而且，我們對xCELLigence系統對神經保護作用的監測能力進行了研究。出于這個目的，我們使用神經保護劑BI-6C9，BI-6C9是一種公認的BH-3
小分子抑制劑，可與死亡激動劑（domain death agonist，BID）發生相互作用，是Bcl-2基因家族的預凋亡成員[4, 5]。
總之，研究表明，xCELLigence系統可通過多方面實驗，持續對神經細胞培養進行監測，所進行的實驗包括接種反應板、預培養、增殖膠質細胞的去除、藥物作用，以及對神經毒性與神經保護作用的確認。
1 材料與方法
1.1 HT-22類神經元細胞
按照指定密度接種HT-22細胞于96孔 E-反應板96（羅氏）或常規96-孔反應板（Greiner，Frickenhausen）上，并生長于DMEM培養基（德國 Karlsruhe, Invitrogen 公司）中，培養基中添加有10%熱失活胎牛血清（FCS）、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml鏈霉素與2 mM 谷氨酸（德國 PAA Laboratories 有限公司）。
1.2 原代皮質神經元培養
如前述，原代皮質神經元細胞來自于胎鼠大腦（E16-18）[4]。簡言之，即分離皮質組織、輕柔胰酶消化后，機械分離神經元，并去除腦膜。將不同密度細胞接種于聚乙烯亞胺 （polyethylenimine，PEI） 預包被 96-孔 E-Plates 96（Roche）或標準 96-孔板（Greiner）中。培養基為神經細胞培養基 （Invitrogen） 添加有5mM HEPES、1.2 mM 谷氨酸、2% （v/v） B27 補充劑（Invitrogen）與慶大霉素（0.1 mg/ml）。培養 48 小時后，使用胞嘧啶-阿糖胞苷（cytosine-arabinofuranoside，CAF）處理 48 小時，抑制非神經元細胞的生長。然后，體外培養 6-7 天后，完全更換培養基，將神經元細胞用于下述實驗。為對谷氨酸處理神經元細胞CI 值的改變進行監測，必須于培養第0天，于細胞中添加 1 μM CAF。
1.3 細胞增殖檢測
根據細胞增殖試劑盒I（MTT）（羅氏）的說明書，通過比色MTT（3-[4,5-二甲基砷-2-yl] -2,5-溴化噻唑藍四氮唑） 檢測，對神經元細胞活性進行檢測。通過自動FLUOstar Optima 讀取儀（德國 Offenburg ，BMG Labtech）進行 570 nm培養孔的吸光度讀取，參考過濾波長是 630 nm。
1.4 實時細胞分析
使用 xCELLigence RTCA MP 儀器與 RTCA 軟件1.2 進行 CI 值測定，并于 E-Plate 96 中進行持續監測。用100 μl DMEM含10% FCS進行HT-22細胞培養的背景阻抗檢測，用100 μl 神經細胞基礎培養基含2% B27進行神經細胞培養的背景阻抗檢測。PEI 包被不會干擾細胞阻抗測定。相反，多聚-D-賴氨酸或多聚-L-賴氨酸包被可顯著干擾原代皮質神經元的實時監測。對 HT-22 細胞持續監測 2 天，對原代皮質神經元細胞持續檢測 12-14 天。