實驗方法原理 這個方案主要用于制備大量 M13 噬菌體的雙鏈 DNA，因在實驗室中 M13 噬菌體經常被用作克隆載體，以及在某些特殊用途時需要制備大量的單鏈噬菌體 DNA，如當一個特定的重組體被多次用于制備反射性標記探針或構建大量定點突變體時。
實驗材料 大腸桿菌 F' 菌株M13 噬菌體原液
試劑、試劑盒 乙醇NaCl酚氯仿聚乙二醇乙酸鈉STETETris-HCl
儀器、耗材 瓊脂糖凝膠LB 或 YT 培養基Sorvall GSA 轉頭或相同的轉頭Sorvall SS-34 轉頭或相同的轉頭Corex 離心管硅橡皮圈無菌試管
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
乙醇
NaCl （固體）
酚
酚：氯仿（1：1，V/V)
聚乙二醇（20%，m/V，PEG 8000) 溶于水。
乙酸鈉（3 mol/L，pH 5.2）
STE
TE ( pH 8.0)
Tris-HCl ( 10 mmol/L, pH 8.0)
2. 凝膠
瓊脂糖凝膠（1.2%) 懸于 0.5 X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙錠
3. 培養基
5 mmol/L MgCl2 的 LB 或 YT 培養基
4. 離心機和轉頭
Sorvall GSA 轉頭或相同的轉頭
Sorvall SS-34 轉頭或相同的轉頭
5. 專用設備
Corex 離心管（30 ml)
硅橡皮圈
無菌試管（13 mm x 100 mm 或 17 mm x 100 mm)
6. 載體和菌株
大腸桿菌 F' 菌株（從用適當宿主菌新劃線分離的 M9 基本瓊脂平板上挑去一個單菌落，接種至一個含 5 ml LB 的 20 ml 的無菌培養試管。溫和振蕩 37℃ 培養 24~36 h，不要使菌生長至穩定期，否則會增加 F' 質粒編碼的菌毛丟失的危險。M13 噬菌體的單鏈 DNA 如果是用于作為寡核苷酸介導的突變，則其應在含 dut 和 ung 基因突變的大腸桿菌中增殖。）
M13 噬菌體原液
二、方法
M13 噬菌體 RF DNA 制備
1. 將 2.5 ml 鋪板菌液轉移至無菌試管（13 X 100 mm 或 17 X 100 mm）。加 0.5 ml M13 噬菌體原液（約 5 X 1011 pfu)，輕拍試管壁混合，室溫放置 5 min。
2. 將感染細胞用裝在 2 L 搖瓶中的 250 ml 預熱至 37℃ 的含 5 mmol/L MgCl2 的 LB 或 YT 培養基稀釋。37℃ 持續振蕩培養 5 h。
3. 4℃ 4000 g ( Sorvall GSA 轉頭為 5000 r/min) 離心 15 min 收集感染細胞。回收上清可用于按以下步驟 7~17 的方法大規模制備 M13 噬菌體的單鏈 DNA。
4. 細菌沉淀用 100 ml 冰冷的 STE 重懸，4℃ 4000 g (Sorvall GSA 轉頭為 5000 r/min) 離心 15 min 回收洗后的細胞。
5. 用堿裂解的方法分離噬菌體閉合環狀 RF DNA。適當增大裂解液的體積。純化 DNA 可用 PEG 沉淀或層析柱純化或 CsCI 梯度離心。
6. 用分光光度法測定 DNA 濃度，并用凝膠電泳法確定其完整性。將閉合環狀 DNA 分成小份 -20℃ 凍存。
250 ml 感染細胞的 RF DNA 的產量為約 200 μg。
M13 噬菌體單鏈 DNA 制備
7. 從感染細胞培養液中的噬菌體顆粒中分離單鏈 DNA, 將步驟 3 的上清轉移至一加有磁攪拌子的 500 ml 燒杯。
8. 上清中加入 10 g PEG 和 7.5 g NaCl, 室溫攪拌 30~60 min。
9. 4℃ 10000 g ( Sorvall GSA 轉頭為 7800 r/min) 離心 20 min 收集沉淀，倒置離心瓶 2~3 min, 使上清流凈，用 Kimwipes 紙巾吸去瓶壁和頸上殘留的上清。
10. 瓶中加入 10 ml 10 mmol/L 的 Tris-HCl ( pH 8.0)，攪動瓶中溶液，并用巴斯德吸管充分沖洗瓶壁，當噬菌體沉淀溶解后，將溶液移至 30 ml Corex 離心管中。
11. 在噬菌體懸液中加入等體積的酚，用硅橡膠塞塞緊后劇烈振蕩 2 min, 混勻內容物。
12. 室溫以 3000 g ( Sorvallss-34 轉頭用 5000 r/min) 離心 5 min, 上層水相轉移至一個新管，再用 10 ml 酚: 氯仿抽提。
13. 將等量的水相轉移至兩個 30 ml Corex 離心管中，各加入 3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.2 ) 0.5 ml 和乙醇 11 ml。充分混合后室溫放置 15 min。
14. 4℃ 12000 g（Sorvall SS-34 轉頭為 10000 r/min）離心 20 min 回收單鏈 DNA 沉淀， 小心移去上清。
15. 每個管中加入 30 ml 4℃ 70% 乙醇，4℃ 12000 g ( Sorvall SS-34 轉頭為 10000 r/ min) 離心 10 min, 小心盡可能移去上清，倒置離心管使沉淀中的殘液流盡，用 Kimwipes 紙巾吸干管頸處。
16. 室溫放置，使殘余乙醇蒸發，用 1 ml TE ( pH 8.0) 溶解沉淀，-20℃ 貯存。
17. 用分光光度法測定 DNA 濃度，并用瓊脂糖電泳法確定其完整性，將閉合環狀 DNA 分成小份（10~50 μg) -20℃ 貯存。