實驗方法原理
可調孔玻璃（CPG，Bioran）有多微孔的結構，是一種特殊的有較大表面的燒結玻璃，現在已經被用于直接的酶固定的活化型。這個實驗使用 46 nm 孔寬的可調孔玻璃和甘油，通過一個硅氧烷橋結合到玻璃的表面。甘油被偏高砩酸鹽氧化產生乙醛玻璃（圖 1）。由亞苯基二胺形成希夫堿，并通過減少硼氫化鈉來穩定結合。在亞硝酸存在的時候末端氨基被轉化為重鹽陽離子。蛋白質通過酪氨酰殘基固定到重氮基上。
實驗材料 酶溶液
試劑、試劑盒 NaIO4NaBH4對亞苯基二胺磷酸鉀
儀器、耗材 可調孔玻璃
實驗步驟
1. CPG 珠子的活化
CPG 珠子（1 g）放入一個 100 ml 的圓底長頸瓶中，并向瓶中加入 70 ml 溶有 91 mg NaIO4 的水溶液。長頸瓶在旋轉蒸發器上 0.3～0.4 bar（1 bar＝105 Pa）的壓力下旋轉 1 h。用 350 ml 的水將產生的乙醛玻璃沖洗幾次，隨后將 77 mg 對亞苯基二胺溶于 70 ml 水中加入其中，將混合液在 0.3～0.4 bar 下旋轉。在 20 min 后添加 7 mg NaBH4，60 min 后用 20 ml 的水劇烈沖洗玻璃珠 3 次。88 ml 2 mol/L HCl 添加到玻璃珠中，長頸瓶在冰浴中旋轉，使其溫度保持在 0℃。20 min 內，將 1.12 g 的 NaNO2 慢慢地添加一部分，在其間長頸瓶在非真空狀態下一直轉動。在添加了最后一部分之后，長頸瓶必須用一個弱的噴水式真空推進器旋轉 10 min（大約 20 mbar），用于排出含氮氣體。產生的重氮基玻璃用 20 ml 的冰水沖洗 3 次，之后必須馬上用于固定。在用于固定之前的這段時間必須保存于 4℃。
2. 酶的固定
酶溶液（10 mg 溶于 10 ml 的 0～1 mol/L pH 7.5 磷酸鉀）被添加到 25 ml 裝有玻璃珠子的長頸錐形瓶中，長頸瓶在 4℃ 緩慢旋轉過夜（12～16 h）。其后玻璃珠子用 5 ml 0.1mol/L pH 7.5 的磷酸鉀溶液沖洗 3 次。浮在表面的緩沖溶液被收集，用來決定未被固定的蛋白質和酶的活性，用這種方法來評估固定的效率。