藥物對動物體內NK細胞活性的影響實驗

實驗方法原理

肺癌是最常見的嚴重嚴脅人類健康和生命的惡性腫瘤之一， 機體免疫功能低下，與肺癌的發生發展密切相關。

實驗材料 小鼠

試劑、試劑盒 RPMI1640 培養基中止液Hank. s曲拉通X-100

儀器、耗材 酶聯免疫監測儀96 孔24 孔平底培養板離心沉淀機

實驗步驟

1.  動物分組及用藥

（1）將40只小鼠隨機分為正常對照組10只和荷瘤組30只。

（2）正常組于右腋下皮下注射生理鹽水0.2 ml/只，荷瘤組右腋下皮下注射瘤細胞懸液0.2 ml/只。

（3）荷瘤組隨機分為3組，并于肺俞及接種局部脫毛（腧穴定位參考林文編5實驗針灸學6），于次日開始治療。

（4）模型對照組貼敷無藥硬膏。

（5）局部貼敷組用抗癌膏貼敷接種局部。

（6）穴位貼敷組用抗癌膏貼敷肺俞穴及接種局部，各組均隔日更換膏藥，共治療14天。

（7）正常對照組不做藥物處理。于第15日處死小鼠，摘眼球取血，取脾臟。

2.  檢測方法：脾NK細胞活性檢測。

（1）脾NK細胞的制備

①無菌取小鼠脾臟，制成脾細胞懸液，離心后取沉底脾淋巴細胞

②用含10%FCS的1640完全培養液移入100 ml 細胞培養瓶中

③37℃、5%CO2下培養4 h，調整細胞濃度為6×106/ml，備用。

（2）靶細胞：傳代培養的YAC-1細胞在實驗前一天換液，調整濃度為3×105/ml。

（3）NK細胞殺傷活性的測定

①用96孔細胞培養板。

②每份樣品設

a：效應細胞自發釋放孔（效應脾細胞0.1 ml，完全培養液0.1 ml）

b：靶細胞自發釋放孔（靶細胞0.1 ml，培養液0.1 ml）

c：殺傷實驗孔（靶細胞0.1 ml，效應脾細胞0.1 ml）

d：最大殺傷實驗孔同c，每孔設3個重復孔，離心，棄上清液0.1 ml，加入0.1 ml 2%X-100。

③于37℃、5%CO2下培養24 h，離心（1000 rpm，5 min）。

④棄上清液，每孔加NAG酶反應物液100 ul，置濕盒37℃溫育40 min。

⑤每孔加中止液100ul，在酶聯檢測儀410 nm處測A值，分別以a、b、c、d表示。

⑥按下公式計算NK細胞殺傷活性：細胞毒指數（CI）=（a+b）-c（a+b）-d×100%。

3.  IL-活性測定：

（1）脾細胞制備同上。

（2）IL-2的誘生

①將6×106/ml脾細胞懸液加入24孔培養板中，調整細胞濃度為10 ug/ml。

②37℃、5%CO2下培養48 h（1000 rpm，10 min）收集上清液。

③無菌塑尖管為待測樣品，-20℃保存檢測活性。

（3）活性測定

①以IL-2依賴細胞株CTLL-2為靶細胞，用20%FCS的1640培養液調整濃度為2.5×105/ml，加入96孔培養板，每孔100 ul。

②再加入100 ul待測樣品，每份樣品設三個重復孔，并設陰性對照孔。

③培養48 h后離心（2000 rpm，10 min），棄上清液。

④加NAG酶反應底物100 ul，置濕盒37℃溫育40 min后，每孔加中止液100 ul，在酶聯檢測儀410 nm處測A值。

⑤按下列公式計算CTLL-2增殖率，表示IL-2活性。增殖率（%）=樣品A值-陰性對照孔A值陰性對照孔A值×100%。

4.  統計方法采用 t 檢驗。

其他

一、討論

NK細胞是一類重要的免疫調節細胞，它具有抗腫瘤、抗感染、免疫調節等作用，它的抗腫瘤機制為：

（1）通過其表面的受體，識別腫瘤細胞上的靶結構直接殺傷之，或通過釋放可溶性介質來殺傷腫瘤細胞。

（2）NK細胞表面有FcCR受體，它可以與覆蓋在腫瘤細胞上的抗體的Fc段相結合，對腫瘤細胞發揮細胞毒作用。

（3）NK細胞能釋放干擾素C（IFN-C）、I-l1、IL-2等細胞因子來加強抗瘤作用。

NK細胞處于機體抗腫瘤的第一道防線。對抑制腫瘤的生長、發展、轉移都具有重要意義。IL-2在腫瘤免疫中也具有重要作用，其作用機制為：

（1）刺激NK細胞的生長，增強NK細胞的溶細胞活性。

（2）誘導CTL、LAK等腫瘤殺傷細胞的分化和效應功能。

（3）誘導腫瘤殺傷細胞產生IFN-C、TNF-a等細胞因子，增強抗瘤效應。

（4）活化巨噬細胞促進殺瘤效應，臨床常用IL-2注射來抑制腫瘤取得一定療效。

NK細胞表面具有IL-2受體，在IL-2刺激下可出現細胞增殖反應，并產生IFN-a等細胞因子，IL-2、IFN-a、IFN-C可協同作用提高NK細胞的活性，以IL-2作用最突出。NK細胞和lL-2之間相互促進而發揮殺瘤作用。

本療法針對肺癌本虛標實證，以扶正祛邪為原則，益氣滋陰、清熱解毒、軟堅散瘀為治則，選西洋參益氣養陰，黃芪補氣升陽，益肺固脾，鹿角膠補益肝腎，滋養精血，3味主藥合用而調補陰陽益氣養血；白花蛇舌草、山慈菇清熱解毒；穿山甲、海藻軟堅散結；水蛭、莪術破血逐瘀。

諸藥合用而達扶正抗癌之效。抗癌膏貼敷肺俞穴，是因為肺俞穴為肺臟經氣輸注之處，位置又與肺臟實際部位相對應，為治療肺疾之要穴，而且從俞穴的皮膚特點來看，背部皮膚較四肢為薄，藥物易滲透至皮下組織而發揮療效，故肺俞穴為穴位貼敷治療肺癌的最佳穴位。

研究證實：抗癌膏中的黃芪，其藥理成分黃芪甙能增強細胞免疫功能，促進IL-2產生，其水煎劑可促進NK細胞活性，西洋參中含的人參皂甙Rd，經體內動物實驗證實，可以提高NK細胞活性和干擾素C的產生水平，增強免疫機能，增強小鼠抑瘤率，減輕瘤重；鹿角膠中含鹿茸精及膠質蛋白等，可以增加心、腎功能，3藥合用，改善機體免疫功能。

白花蛇舌草、山慈菇為清熱解毒藥，可抑制或殺滅腫瘤細胞；水蛭、莪術等活血化瘀藥可擴張血管，改善晚期肺癌的血瘀證，抑制血栓形成，減少腫瘤轉移；海藻、穿山甲可升高機體白細胞，提高機體免疫功能，抑制腫瘤生長，縮小腫瘤體積。

本療法用抗癌膏貼敷肺俞穴治療肺癌的機理是：在藥物和穴位的雙重作用下，增強NK細胞活性與T細胞分泌IL-2的能力，提高干擾素的誘生水平，從而改善機體的免疫功能。腫瘤病人，尤其是進展期病人，其外周血中T細胞分泌IL-2水平低于正常人，NK細胞活性也低于正常人，因此用抗癌膏進行肺俞穴貼敷，可以通過提高NK細胞活性和IL-2誘生水平來提高病人免疫功能，從而對肺癌起到治療作用。