實驗概要
本實驗建立一種快速、簡易的檢測血清中抗幽門螺桿菌(Hp)細胞毒素相關蛋白A(CagA)抗體的膠體金免疫層析法(GICA)。方法采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標記葡萄球菌A蛋白(SPA)，將重組的CagA抗原劃線固定于硝酸纖維素膜上，制成免疫層析檢測試條。 血清中IgG與測試條上金標記物結合后沿著硝酸纖維素膜移動，與膜上的固相抗體結合形成肉眼可見的紅色線條。
實驗原理
膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，形成帶負電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩定的膠體狀態，故稱膠體金。膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。
膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。
膠體金標記，實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是膠體金顆粒表面負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價結合，因而在基礎研究和臨床實驗中成為非常有用的工具。
免疫金標記技術(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。
主要試劑
1. 氯金酸(HAuCl·Cl3·4H2O)
2. 葡萄球菌A蛋白(SPA)
3. 細胞毒素相關蛋白A(CagA)
4. 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測抗CagA-IgG試劑盒
主要設備
1. Z 323 K低溫高速離心機
2. LGJ 0.5-Ⅱ冷凍干燥機
3. 點膜器
實驗材料
血清標本
實驗步驟
1. 15 nm膠體金的制備
其步驟為：去離子水溶解氯金酸使其終濃度為0.2 g/ L，煮沸后每100 mL加入10 g/ L檸檬酸三鈉水溶液4 mL，繼續煮沸7min. 電鏡觀察膠體金的粒度。
2. 免疫膠體金的制備
取顆粒直徑為15 nm的膠體金100 mL，用0.1 mol/ L K2CO3調至pH 6.2，在攪拌狀態下加入SPA(1 g/ L) 0.6 mL，繼續攪拌10min；加入50 g/ L BSA 10 mL，繼續攪拌5min. 4℃下3000 r/ min離心5min，棄沉淀，上清液以12 000 r/ min離心15min，小心移去上清液，沉淀即為制備的膠體金。用20 mL懸浮液懸浮沉淀，以吸水纖維吸附后冷凍干燥4 h，4℃保存備用。
3. 免疫層析測試條的制備
測試條由吸水纖維、硝酸纖維素膜和吸水濾紙三部分組成。吸水纖維部分附著有膠體金免疫復合物；在硝酸纖維素膜上用CagA(1.5 mg/ L)及人IgG(1 mg/ L)劃線(1 mm寬)，分別作為檢測線和對照線，晾干，用50 g/ L BSA封閉2 h，以0.01 mol/ L PBS洗滌3次，干燥后依次粘于白色塑料片(支持物)上，切成0.5 cm×10 cm的試條，加干燥劑密封保存。
4. 抗Hp-CagA IgG的檢測以新鮮血清為佳。 試管中加入0.1 mL～0.2 mL血清，將測試條含有金標記物的一端插入血清內即可。結果判定：以測試條硝酸纖維素膜上出現兩條紅色條帶為抗Hp-CagA IgG陽性；僅出現一條紅色條帶(靠近吸水濾紙端，對照線)為陰性。如果無紅色條帶出現則視為試劑失效。結果確定時間：強陽性標本在5min內即可在檢測線處見到紅色膠體金顆粒聚集；弱陽性標本約需要10min確定結果。