一、蛋白質組學概論
隨著人類基因組計劃的實施，生命科學步入了后基因組時代，出現了不同于以往經典生物實驗科學的全新的研究方式─“生物大科學”。這種生物大科學的核心思想是整體性研究，即以生物體內某類物質為對象進行完整的研究。過去對生命活動的研究僅限于研究細胞內個別的基因或蛋白質，而基因組學和蛋白質組學的目標則是細胞內全部的基因和蛋白質。因此，生物大科學與經典實驗生物學在研究思路上有一個重要的區別：前者通常不針對具體的生物學問題或科學假設，其目標主要是把全部研究對象測定清楚，被稱為“發現的科學”（Discovery
Science）；而后者屬于“小科學”，其實施則離不開具體的生物學問題或科學假設，被稱為“假設驅動的科學”(Hypothesis-driven
Science)。顯然，生物大科學與經典實驗生物學各有其所長，前者“廣”而后者“深”。如何把這二者有機地結合起來，使得人們能夠更深刻更全面的揭示生命復雜體系和行為，這是后基因組時代生命科學工作者面臨的重要課題，系統生物學（Systems
Biology）就是針對這樣一個時代需求而產生的生命科學研究領域的一門新興學科。它以基因組學和蛋白質組學為基礎，通過實驗觀察和數學建模的反復迭代過程來描述和預測生物系統的動態行為。
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蛋白質組學是系統生物學的基礎和組成部分之一，在后基因組學時代的地位尤為突出。蛋白質組學的內容包括：表達蛋白質組學（expression
proteomics）、結構蛋白質組學（structural proteomics）和功能蛋白質組學（functional
proteomics）。雙向電泳是蛋白質組學研究的經典方法之一，特別是對于表達蛋白質學的研究是不可缺少的手段。
雙向電泳（two-dimensional gel electrophoresis,
2-DE）是一種分析從細胞、組織或其他生物樣本中提取的蛋白質混合物的有力手段，是目前唯一能將數千種蛋白質同時分離與展示的分離技術，其高分辨率、高重復性和兼具微量制備的性能是其他分離方法所無與倫比的。雙向電泳技術、計算機圖像分析與大規模數據處理技術以及質譜技術被稱為蛋白質組研究的三大基本支撐技術。可見雙向電泳在蛋白質組學研究中的重要性。就像Fey和Larsen在他們的綜述中提到：“盡管人們都想有新技術取代它，可是如果希望對細胞活動有全面的認識，其他技術無法在分辨率和靈敏度上與雙向電泳相媲美
”。
雙向凝膠電泳是一種由任意兩個單向凝膠電泳組合而成的，即在第一向電泳后再在與第一向垂直的方向上進行第二向電泳。雙向電泳的思路最早是由Smithies和Poulik提出，蛋白質第一向根據其自由遷移率（free-solution
mobility），在濾紙條上進行的；第二向電泳方向與第一向垂直，在淀粉膠上進行。隨著聚丙烯酰胺凝膠的發明，雙向電泳支持介質逐漸轉向聚丙烯酰胺凝膠，即雙向凝膠電泳。1969年，雙向電泳在原理上有了新的發展，建立了以等電聚焦為第一向的雙向電泳技術（即IEF-PAGE）。20世紀70年代初，第二向電泳中使用了十二烷基硫酸鈉（SDS），使第二向電泳基本上根據蛋白質的相對分子質量來分離，從而奠定了現代雙向凝膠電泳的基礎.1975年O′Farrell首先建立了等電聚焦/SDS-聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳（IEF/SDS-PAGE），至今仍不失為雙向凝膠電泳首選的組合方式。在這項組合中，IEF為第一向電泳，是基于蛋白質的等電點不同用等電聚焦法分離，第二向則按分子量不同用SDS-PAGE分離，把復雜的蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開。近年來經過多方面改進，已成為研究蛋白質組的最有價值的核心方法。目前，雙向電泳最高可達11
000個蛋白點的分辨率。所以在上世紀90年代中期Wilkins提出蛋白質組學這一概念后，雙向電泳即成為這個革命性課題的開門技術。
目前，雙向電泳主要指O′Farrell建立的等電聚焦/SDS-聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳（IEF/SDS-PAGE）的模式。其基本原理是：先將蛋白質根據其等電點在pH梯度膠內（載體兩性電解質pH梯度或固相pH梯度）進行等電聚焦，即按照它們等電點的不同進行分離。然后按照它們的相對分子質量大小進行SDS-PAGE第二次電泳分離。樣品中的蛋白經過等點電和分子質量的兩次分離后，可以得到分子的等電點、分子質量和表達量等信息。值得注意的是，雙向電泳分離的結果使蛋白質點而不是條帶。根據Cartesin坐標系統，從左到右是pI的增加，從下到上是分子質量的增加。
二、樣品制備
1．[基本原理]
要獲得高分辨率和高度重復的雙向電泳圖譜，蛋白質樣品制備是極為關鍵的一步，這一步處理的好壞將直接影響雙向電泳的結果。目前并沒有一個通用的制備方法，盡管處理方法是多種多樣，但都遵循幾個基本的原則：（1）盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質的損失；（2）減少對蛋白質的人為修飾；（3）破壞蛋白質與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質處于完全變性狀態。
根據這一原則，我們制備裂解液來抽提蛋白。裂解液的基本成分為尿素、去垢劑、還原劑和兩性電解質等。尿素是一種優良的變性劑，通過斷裂氫鍵和疏水鍵使蛋白質變性，增加其溶解性，而不影響蛋白質所帶的電荷。尿素和硫脲結合使用蛋白質的溶解性會更好，尤其是疏水性的膜蛋白。去垢劑有離子型、非離子型和兼性離子型等幾類。離子型去垢劑，如SDS使蛋白質帶上負電荷，干擾第一向等電聚焦而避免使用。傳統的非離子去垢劑，早期常使用NP-40、TritonX-100等，近幾年較多的改用如CHAPS與Zwittergent系列等兼性離子去垢劑代替。還原劑多數使用β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇（DTE）通過打斷二硫鍵使蛋白質徹底變性。兩性電解質能促進蛋白質的的溶解，吸附高濃度的尿素在溶液中形成氰酸鹽離子(cyanate
ions)，離心時還有助于核酸的沉淀。樣品中的核酸大分子會干擾等電聚焦和雙向膠的銀染，加入核酸水解酶或采用超聲的方法可將其降解。為避免樣品制備過程中蛋白質的降解，整個過程需要在yena中（約4℃）進行，并可加入蛋白酶抑制劑.