有三種常用的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法:blue native(BN-PAGE),clear native(CN-PAGE),quantitative preparative native continuous(QPNC-PAGE)。
在一個典型的native
PAGE方法中,復合物被CN-PAGE或BN-PAGE分離。然后可以用其它分離方法如SDS-PAGE或等電聚焦做進一步分離。隨后切割凝膠,蛋白復合物每一個部分都被分開。蛋白的每個條帶可以消化后做肽鏈指紋圖譜或重新測序。這樣就可以提供一個蛋白復合物中單個蛋白的重要信息。
1. Blue Native PAGE
Blue Native
PAGE是最古老的Native-PAGE技術。是以考馬斯亮藍作為電泳分離后蛋白質鑒定染料的一種電泳方法。這種方法的缺點是:考馬斯亮藍與蛋白的結合起到了去垢劑的作用,可能導致復合物的分離;并對化學發光或蛋白質輔基的熒光或熒光染料的標記具有潛在的猝滅作用。
Blue Native PAGE在分析蛋白質-蛋白質相互作用以及膜蛋白復合物方面有很大的優勢,其分離范圍在100KDa-10MDa。在Blue
native
PAGE過程中,最重要的化合物就是考馬斯亮藍,除了增溶作用以外,蛋白質表面結合了大量的考馬斯亮藍染料而帶上負電荷,這會導致即使堿性蛋白在
pH7.5條件下也會向陰極遷移。但是,蛋白質雖然帶有大量的負電荷,然而其分離依據的根本還是根據不連續的凝膠梯度-凝膠孔徑的逐漸減小,蛋白質最終遷移到其自身大小與凝膠孔徑相近似的位置而停止。并且在分離膜蛋白的過程中,由于帶有負電荷,而不會引起蛋白聚合,與酸性染料的結合,膜蛋白也由疏水性變成親水性,溶解性大大提高。
1.2 Clear Native PAGE
Clear Native PAGE是通過除染色以的其它方法如SLS鑒定蛋白的電泳技術。然而,這種方法最大的應用還是研究蛋白質-蛋白質相互作用,特別是和質譜聯用。
Clear Native
PAGE是在聚丙烯酰胺凝膠中分離酸性水溶性蛋白和膜蛋白(PI<7)的電泳技術,分辨率通常比BN-PAGE低。遷移距離決定于蛋白的固有電荷和凝膠孔徑大小。因此,BN-PAGE比CN-PAGE應用更廣泛。然而CN-PAGE在考馬斯染料分析天然混合物干擾進一步分析時存在著優勢。如測定催化活性(例如線粒體ATP合酶)或分離用于熒光共振能量分析的微量膜蛋白,CN-PAGE比BN-PAGE更溫和,特別是使用洋地黃皂苷時,CN-PAGE
可以保持膜蛋白的超分子組合體的結構而BN-PAGE會導致分解。線粒體ATP合酶中的具有酶活性的低聚物可以用CN-PAGE檢出,但BN-PAGE無法檢出。
CN-PAGE起源于無色非變性PAGE,是BN-
PAGE之后出現的技術。既然CN-PAGE中沒有帶電荷的染料,蛋白在電場中的遷移完全取決于這個蛋白的固有電荷。大分子和低聚蛋白必須有合適的物理參數才能在CN-PAGE中分開,特別是PI低于5.4,分辨率低。由此看來,CN-PAGE除了獲得未染色的蛋白以外在分析膜蛋白中沒有什么優勢了。優點是條件更溫和,在蛋白質組學研究中具有更大優勢。BN-PAGE和CN-PAGE的緩沖液和電泳條件一致,但是CN-PAGE的陰極緩沖液中不含考馬斯染料,而是將0.025%的洋地黃皂苷加入到凝膠中。
1.3 QPNC-PAGE
QPNC-PAGE(quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel
electrophoresis)是一種應用于生物化學和生物有機化學的根據等電點分離蛋白的高分辨技術。這種凝膠電泳被生物學家應用于獨立活性或天然金屬蛋白樣品或正確或非正確折疊的可溶性的與金屬輔助因子結合的蛋白混合物的鑒定。
1.3.1電泳緩沖液
QPNC-PAGE是在特殊的裝置里進行的分離生物活性分子的電泳過程。在特殊的電泳緩沖系統(基于Tris-HCl和NaN3)中,一個生物系統中的大多數蛋白都會帶電荷,在電場的正負極之間遷移。
盡管PH(10.00)的電泳緩沖液并不與細胞或組織中的生理PH相符,但是在生理PH(8.00)的緩沖體系下蛋白會連續洗脫并分成不同的部分。分離系統包括電泳槽和分部收集器,這些裝置要置于冰箱中。
1.3.2凝膠特征
為了得到一個PAGE所需的聚合完全的凝膠,聚丙烯酰胺凝膠需要在室溫下凝聚69hr。最后,得到均質的含機械穩定和自由的單體或原子。凝膠的孔徑很大,因此分子篩作用在電泳分離中最小化。基于上述原因,凝膠和活性分子之間的相互作用可以忽略。待分離的金屬蛋白(如金屬分子伴侶,蛋白酶感染性初級因子,金屬運輸蛋白,淀粉狀蛋白,金屬酶,金屬肽等)不會分解成脫輔蛋白和金屬輔助因子。孤立蛋白的生物活性結構(天然或3D構象)在QPNC-PAGE后不會發生構象變化。所以,金屬蛋白和蛋白異構體在PAGE中被定量的分成高純度的部分。QPNC與其它電泳技術如SDS-PAGE,2-DE,等速電泳和
CN- PAGE等相比被稱為“突破性的方法”。