2、將長、短玻璃板分別插到 形硅橡框的凹形槽中。注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。
3、將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應面對上貯槽。
4、將下貯槽的銷孔對準已裝好螺絲銷釘的上貯槽，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽。
5、豎直電泳槽，在長玻璃板下端與硅膠模框交界的縫隙內加入已融化的1%瓊脂（糖）。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂（糖）中應避免有氣泡。
（二）配膠及凝膠板的制備
1．配膠
根據所測蛋白質分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。由于SDS-PAGE有連續系統及不連續系統兩種，兩者間有不同的緩沖系統，因而有不同的配制方法，見表16-5和表16-6。
表16-5 SDS-不連續體系凝膠配制
電極緩沖液為pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液，內含0.1%SDS。
電極緩沖液為0.1mol·L-1 pH7.2磷酸緩沖液，內含0.1%SDS。
2．凝膠板的制備
（1）SDS- 不連續體系凝膠板的制備
●分離膠的制備：按表16-5配制20ml10%分離膠，混勻后用細長頭滴管將凝膠液加至長、短玻璃板間的縫隙內，約
8cm高，用1ml注射器取少許蒸餾水，沿長玻璃板板壁緩慢注入，約3—4mm高，以進行水封。約30min后，凝膠與水封層間出現折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多余水分。
●濃縮膠的制備：按表16-5配制10ml3%濃縮膠，混勻后用細長頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約0.5cm處，輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內，約30min后凝膠聚合，再放置20—30min，使凝膠“老化”。小心拔去樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的水分，將pH8.3
Tris-甘氨酸緩沖液倒入上、下貯槽中，應沒過短板約 0.5cm以上，即可準備加樣。
（2）SDS-連續體系凝膠板的制備：按表16-6配制20ml所需濃度的分離膠，用細長頭滴管將分離膠混合液加到兩塊玻璃板的縫隙內直至距離短玻璃板上緣0.5cm處，插入樣品槽模板。為防止滲漏，可在上、下電極槽中加入蒸餾水，但不能超過短板，以防凝膠被稀釋，約30min，凝膠聚合，繼續放置20—30min后，倒去上、下電極槽中的蒸餾水，小心拔出梳形樣品槽模板，用窄條濾紙吸去殘余水分，注意不要弄破凹形加樣槽的底面。倒入電極緩沖液即可進行預電泳或準備加樣。
（三）樣品的處理與加樣
1．樣品的處理
根據分子量標準蛋白試劑盒的要求加樣品溶解液，如上海東風生化試劑廠生產的低分子量標準蛋白試劑盒，每一安瓿則需加入200μL樣品溶解液，自己配制標準及未知樣品，按.5—1mg/1mL樣品溶解液，溶解后，將其轉移到帶塞小離心管中，輕輕蓋上蓋子（不要塞緊以免加熱迸出），在100℃沸水浴中保溫3min，取出冷卻后加樣。如處理好的樣品暫時不用，可入在—20℃冰箱保存較長時間，使用前在
100℃沸水中加熱3min，以除去亞穩態聚合。
2、加樣
一般每個凹形樣品槽內，只加一個種樣品或已知分子量的混合標準蛋白質，加樣體積要根據凝膠厚及樣品濃度靈活掌握，一般加樣體積為10—15μL（即2—10μg蛋白）。如樣品較稀，加樣體積可達100μL。如樣品槽中有所泡，可用注射器針頭挑除。加樣時，將微量注射器的針頭通過電極緩沖液伸入加樣槽內，盡量接近底部，輕輕推動微量注射器，注意針頭勿碰破凹形槽膠面。由于樣品溶解液中含有比重較大的蔗糖或甘油，因此樣品溶液會自動沉降在凝膠表面形成樣品層。
（四）電泳
分離脈聚合后是否進行預電泳則應根據需要而定，SDS連續系統預電泳采用30mA60—120min。
1．連續系統
在電極槽中倒入0.1%SDS pH7.2
0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，連接電泳儀與電泳槽，上槽接負極，下槽接正極。打開電源，將電流調至20mA，待樣品進入分離膠后，將電流調至50mA，待染料前沿遷移至距硅橡膠框底邊1—1.5cm處，停止電泳，一般需5—6h。
2．不連續系統
在電極槽中倒入pH8.3Tris-HCl
電級緩沖液，內含0.1%SDS即可進行電泳。在制備濃縮膠后，不能進行預電泳，因預電泳會破壞pH環境，如需要電泳只能在分離膠聚合后，并用分離膠緩沖液進行。預電泳后將分離膠面沖洗干凈，然后才能制備濃縮膠。電泳條件也不同于連續SDS-PAGE。開始時電流為10mA左右，待樣品進入分離膠后，改為
20—30mA，當染料前沿距硅橡膠框底邊1.5cm時，停止電泳，關閉電源。
（五）凝膠板剝離與固定
電泳結束后，取下凝膠模，卸下硅橡膠框，用不銹鋼藥鏟或鑷子撬開短玻璃板，在凝膠板切下一角作為加樣標志，在兩側溴酚藍染料區帶中心，插入細銅絲作為前沿標記。將凝膠板放在大培養皿內，加入固定液，固定守液。
（六）染色與脫色
將染色液倒入培養皿中，染色1h左右，用蒸餾水漂洗數次，再用脫色液脫色，直到蛋白質區帶清晰，即可計算相對遷移率。
（七）結果與分析
1．繪制標準曲線
將大培養皿放在一張坐標紙上，量出加樣端距細銅絲間的距離（cm）以及各蛋白質樣品區帶中心與加樣端的距離（cm），如圖18-6所示。按下式計算相對遷移率mR：
以標準蛋白質的相對遷移率為橫坐標，標準蛋白質分子量為縱坐標在半對數坐標紙上作圖，可得到一條標準曲線。
2．根據未知蛋白質樣品相對遷移率直接在標準曲線上查出其分子量。
3．分析各蛋白質相對遷移率高氏主要是由什么決定的？
注意事項
（1）由于與凝膠聚合有關的硅橡膠稱、玻璃板表面不光滑潔凈，在電泳時會造成凝膠板與玻璃板或硅橡膠條剝離，產生氣泡或滑膠；剝膠時凝膠板易斷裂，為防止引現象，所用器材均應嚴格地清洗。硅橡膠條的凹槽、樣品槽模板及電泳槽用泡沫海綿蘸取“洗潔凈”仔細清洗。玻璃板浸泡在重鉻酸鉀洗液3—4h或0.2mol/L
KOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗凈，再用泡沫海綿蘸取“洗潔凈”反復刷洗，最后用蒸餾水沖洗，直接陰干或用乙醇沖洗后陰干。
（2）安裝電泳槽和鑲有長、短玻璃板的硅橡膠框時，位置要端正，均勻用力旋緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏。樣品槽板梳齒應平整光滑。
（3）在不連續電泳體系中，預電泳只能在分離膠鄉合后進行。洗凈膠面后才能制備濃縮膠。濃縮膠制備后，不能進行預電泳，以充分利用濃縮膠的濃縮效應。
（4）電泳時，電泳儀與電泳槽間正、負極不能接錯，以免樣品反方向泳動，電泳時應選用合適的電流、電壓，過高或過低無可影響電泳效果。
（5）SDS純度：在SDS- PAGE中，需高純度的SDS，市售化學純SDS需重結晶一次或兩次方可使用。重結晶方法如下：稱20g
SDS放在圓底燒瓶中，加300mL無水乙醇及約半牛角匙活性碳，在燒瓶上接一冷凝管，在水浴中加熱至乙醇微沸，回流約10min，用熱布氏漏斗趁熱過濾。濾液應透明，冷卻至室溫后，移至—20℃冰箱中過夜。次日用預冷的布氏漏斗抽濾，再用少量—20℃預冷的無水乙醇洗滌白色沉淀3次，盡量抽干，將白色結晶置真空干燥器中干燥或置40℃以下的烘箱中烘干。
（6）用SDS處理蛋白質樣品時，每次都會在沸水溶中保溫3—5min，以免有亞穩聚合物存在。
（7）標準蛋白質的相對遷移率最好在0.2—0.8之間均勻分布。值得指出的是，每次測定未知物分子量時，都應同時用標準蛋白制備標準曲線，而不是利用過去的標準曲線。用此法測定的分子量只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整的分子量。為測得精確的分子量范圍，最好用其他測定蛋白分子量的方法加以校正。此法對球蛋白及纖維狀蛋白的分子量測定較好，對糖蛋白，膠原蛋白等分子量測定差異較大。
（8）對樣品的要求：應采納低離子強度的樣品。如樣品中離子強度高，則應透析或經離子交換除鹽。加樣時，應保持凹形加樣槽膠面平直。加樣量以10—15μL為宜，如樣品系較稀的液體狀，為保證區帶清晰，加樣量可增加，同時應將樣品溶解液濃度提高二倍或更高。
（9）由于凝膠中含SDS，直接制備干板會產生龜裂現象。如需制干板，則用25%異丙醇內含7%乙酸浸泡，并經常換液，直到SDS脫盡（約需2—3天（，才可制備干板。為方便起見，常采用照像法，保存照片。