維生素B1（硫胺素）的熒光測定法

實驗原理

維生素B1（硫胺素）屬于水溶性維生素，在堿性高鐵氰化鉀通夜中，能被氧化成一種藍色的熒光化合物－硫色素，在紫外線下，硫色素發出熒光。在給定條件下，以及沒有其他熒光物質干擾時，此熒光之強度與硫色素的濃度成正比。利用人造沸石對維生素B1的吸附作用去除樣品中的干擾熒光測定的雜質，然后洗脫維生素B1, 測定其熒光強度。

試劑和器材

一、試劑

堿性高鐵氰化鉀：1mL 1％的高鐵氰化鉀溶液，用15％NaOH 稀釋至15mL。

2.5 mmol/L無水NaAc溶液：205g無水NaAc用水溶解并稀釋至1000mL。

25％酸性KCl溶液：8.5mL濃HCl用25％KCl溶液稀釋至1000mL。

25%KCl溶液; 無水正丁醇; 15％NaOH溶液; 20％(w/v)連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）; 0.04%溴甲酚綠指示劑。

維生素B1標準液的配制：

A) 維生素B1標準儲備液（25μg/mL）：準確稱取標準品維生素B1 100mg溶于0.01mmol/L鹽酸中，稀釋至1000mL，于冰箱中保存。

B) 維生素B1標準工作液：維生素B1標準儲備液稀釋100倍，用冰醋酸調至pH4.5。避光，貯于4℃冰箱。

二、材料

麩皮。

三、器材

試管1.5×15cm（×4），移液管10mL（×1）, 5 mL（×4）；帶塞錐形瓶250mL（×1），沸水浴，布氏漏斗，人造沸石，熒光分光光度計。

操作方法

一、樣品制備

稱取2~10g樣品于100mL三角瓶中，加入50Ml 0.1mol/L鹽酸，攪拌直到顆粒物分散均勻，在沸水浴中水解樣品30min。水解液冷卻后，滴加2mol/L醋酸鈉，用0.04%溴甲酚綠作外指示劑調至pH為4.5。離心10min，3000r/min。向上清液中加入人造沸石2－4g，振搖30min，用布氏漏斗抽濾，用蒸餾水洗滌沸石3次，洗液棄去。然后用5mL酸性KCl攪拌，洗脫3次，洗脫液合并，并用25％酸性KCl溶液定容至25ML。

二、氧化

將5mL樣品凈化液分別加入1、2試管中。在避光條件下將3mL 15％氫氧化鈉溶液加入試管1中，將3mL 高鐵氰化鉀溶液加入試管2中，振搖15s，然后加入10mL 正丁醇，劇烈振搖90s。重復上述操作，用標準工作液代替樣品凈化液。靜置分層后吸去下層堿性溶液，加入2－3g無水硫酸鈉使溶液脫水。

三、測定

1．于激發光波長365nm，發射光波長435nm測量樣品管及標準管的熒光值。

2．待樣品及標準的熒光值測量后，在各管的剩余液（約5~7ml）中加0.1mL 20%連二亞硫酸鈉溶液，立即混勻，在20s內測出各管的熒光值，作為各自的空白值。

四、計算

按下式計算樣品中維生素B1的含量：

式中： X —樣品中含維生素B1的量，mg/100g；

A —樣品熒光值；

B —樣品管空白熒光值；

C —標準管熒光值；

D —標準管空白熒光值；

f —稀釋倍數；

m —樣品的質量，g；

S —標準管中的維生素B1含量，μg；

100/1000 —將樣品中維生素B1量由μg/g折算成mg/100g的折算系數。

注意事項

加入人造沸石要過量，保證維生素B1的定量吸附。