層析柱裝填及柱效測定及凝膠過濾層析2

準備好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白檢測儀及記錄儀

打開柱上端的螺絲帽塞子，吸出層析柱中多余液體直至與膠面相切

沿管壁將5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝膠床面上，應避免

將床面凝膠沖起 （參考完成時間11：30）

打開下口夾子，使樣品溶液流入柱內，同時收集流出液，當樣品溶液流至與膠面相切時，夾緊下口夾子

按加樣操作，用1 mL洗脫液沖洗管壁2次

加入3－4 mL洗脫液于凝膠上，旋緊上口螺絲帽
將層析柱進水口連通恒流泵，柱出水口與核酸蛋白質檢測儀比色池進液口相連，比色池出液口再與自動部分收集器相連，用兩根導線將檢測儀與記錄儀連接起來，設置好基線的位置

洗脫時，打開上、下進出口夾子，用0.02mol/LpH8.0的PBS，以0.5～1 mL/min流速洗脫，記錄tr(記錄儀紙速設為12cm/h，電壓200mv；核酸蛋白監測儀檢測波長254nm，靈敏度為0.1A)， 計算單位高度的柱效 （參考完成時間16：00）

柱效計算公式：N = 5.54?［θr/( W 1/2)］2

其中，θr為平均洗脫時間，W 1/2為半峰寬。均為無因次特性值，測量時精確到1mm。

[Sephadex G-100每米理論塔板數為3000～6000]

四、注意事項

1. 各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。

2. 裝柱要均勻，既不過松，也不過緊，最好在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免因此壓緊凝膠。

3. 始終保持柱內液面高于凝膠表面，否則水分蒸發，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內的流動。

4. 所用凝膠比較昂貴，需小心操作，實驗后回收，盡量避免浪費和損失。

五、演示

（一）核酸蛋白檢測儀及記錄儀操作方法

1. 在儀器使用前，首先檢查檢測器，電源和記錄儀三部份電路連接是否正確，插上電源插頭。

2. 接通記錄儀電源開關，使電源開關拔到“通”指示燈亮。可根據需要調換不同的走紙速度。記錄儀量程調在10mV檔上。

3. 將檢測儀波長旋鈕旋到所需波長刻度上，把量程旋鈕拔到100％T檔。

4. 按下檢測儀電源箱面板上的電源開關，此時記錄儀指針從零點開始向右移動某一刻度，調節“光量”旋鈕使指針停留在記錄儀大約中間位置5mV左右數字顯示為50左右。儀器開機穩定時間大約在1小時左右，待基線平直后，可加樣測試。

5. 把檢測器進樣口塑料膠管接到部份收集器上，使層析柱中的洗脫液通過。透光率為“0”廠家巳調好，光密度A要調零，量程開關拔到100％T，調節光量旋鈕，使記錄儀指針在10mV數字顯示為100，即透光率為100%。把量程開關拔到“A”擋，緩慢調節A調零旋鈕，使檢測儀數字顯示為“0” ， 同時調節記錄儀零位旋紐使記錄儀指示在"0"位 。

6. 上述5個步驟結束后，就可以在層析柱上加樣。當樣品經層析柱分離，通過檢測后，就能通過記錄儀給出所需樣品吸收的圖譜。

7. 測試完畢，必須切斷電源，并用蒸餾水清洗樣品池和尼龍管。

記錄儀光吸收A讀數

當采用l0mV量程記錄儀時，記錄儀的滿量程讀數對應于A量程開關所對應的A讀數范圍。如A量程開關選定在0-0.5A時，則記錄儀滿量程光吸收A讀數為0.5，當記錄筆指示在記錄紙一半 (50%刻度)位置時即為0.25A。

數字顯示光吸收A讀數(可變量程讀數模式)