DNA重組（DNArecombination）技術：DNA重組的載體1

發布時間：2020-09-08 11:56 原文鏈接： DNA重組（DNArecombination）技術：DNA重組的載體1

載體（vector）是攜帶靶DNA（目的DNA）片段進入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具。常用的載體是通過改造天然的細菌質粒、噬菌體和病毒等構建而成。目前已構建成的載體主要有質粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體等多種類型，亦可根據其用途不同分為克隆載體和表達載體二類。

載體的構建和選擇應考慮以下幾個主要的條件：①在宿主細胞中具有自主復制能力或能整合到宿主染色體上與基因組一同復制的能力；②有合適的限制性酶切位點供外源DNA片段插入，多種酶單一位點使載體在使用上具有較大的靈活性；③分子量不宜過大，以便于容納較大的外源DNA片段并獲得較高的拷貝數，也有利于體外重組操作。④具有合適的篩選標記，以便區分陽性重組體和陰性重組體，常用的篩選標記有抗藥性、酶基因、營養缺陷型或形成噬菌斑的能力等。⑤配備與宿主相適應的調控元件，如啟動子、增強子和前導序列等。

一、質粒載體

質粒是細菌染色體以外具有自主復制能力的小型雙鏈環狀DNA分子。在大腸桿菌中，常見的可用于基因克隆的天然質粒有ColE1、RSF2124和 pSC101等。鑒于天然質粒作為克隆載體存在著不同程度的局限性，各實驗室便對其進行修飾改造，并逐步完善。依復制是否受宿主細胞蛋白質合成控制分緊密型質粒（stringent plasmid）和松馳型質粒（relaxed plasmid）。質粒載體大多是在天然松馳型質粒的基礎上經人工改造拼接而成。這類質粒在宿主蛋白質合成及染色體復制停止后尚能繼續復制至上千個拷貝。利用這一原理，在質粒擴增時，通過加入氯霉素抑制大腸桿菌蛋白質合成，達到進一步擴增質粒的目的。

一種用作克隆載體的理想質粒一般具備下述特點：①具有松馳型復制子（如ColE1），復制子（replicon）是質粒自我增殖所必不可少的基本條件，并可協助維持使每個細胞含有一定數量的質粒拷貝。②在復制子外存在幾個單一的酶切位點（或多克隆位點），以便目的DNA片段插入。③具有插入失活的篩選標記，理想的質粒載體應具有兩種抗菌素抗性標志，如氨芐青霉素抗性基因（Ampr）和四環素抗性基因（Tetr）等，以便從平板中直接篩選陽性重組子。④分子量相對較小和較高的拷貝數。此外，質粒的缺點是容量較小，一般只能接受小于15kb的外來DNA，插入片段過大會導致重組子擴增速度減慢，甚至使插入片段失活。

下面介紹幾種有代表性的質粒載體。

㈠ pBR332質粒載體

pBR332質粒就是按這種設想構建的一種大腸桿菌質粒載體。pBR332是最早被廣泛應用于分子克隆的載體之一，至今尚在使用。pBR332的結構如圖7-1所示，是研究得最清楚的質粒，為一個4.36kb的環狀雙鏈DNA。pBR332由三個不同來源的部分組成：①來源于ColE1的派生質粒pMB1的復制起始位點（ori）；②來源于pSF2124質粒易位子Tn3的Ampr；③來源于pSC101質粒的Tetr。

pBR332質粒載體具有下述特點：

1．帶有一個復制起始位點保證該質粒能在大腸桿菌中復制。

2．具有二個抗生素抗性基因（Ampr和Tetr）作選擇標記和數個單一的限制性酶切位點其中三個單一的酶切位點BamHⅠ、HindⅢ和SalⅠ均在Tetr基因內，PstⅠ識別位點在Ampr基因內。當外源基因插入這些抗性位點時，就分別成為Amp敏感（Amps）或Tet敏感（Tets），即插入失活。

3．具有較小的分子量 pBR332質粒載體的這種小分子量特征，不僅易于自身DNA的純化，而且能有效地克隆6kb大小的外源DNA片段。

4．具有較高的拷貝數而且經氯霉素擴增后，每個細胞可累積1 000~3 000個拷貝，這為重組DNA的制備提供了極大的方便。

㈡ pUC質粒載體系列

pUC質粒是在pBR332基礎上改建而成的。它們保留了pBR332的一部分，組入了一個來自M13噬菌體在其5′-端帶有一段多克隆位點的LacZ′基因，而發展成為具有雙重檢測特征的新型質粒載體系列。一個典型的pUC系列的質粒載體包含如下4個組成部分：①來自pBR332 質粒的復制起始位點（ori）；②Ampr基因，但其DNA序列已不再含有原來的核酸內切酶單一識別位點；③大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的啟動子及其編碼α-肽鏈的DNA序列，此結構稱為LacZ′基因；④位于LacZ′基因中靠近5′-端的一段多克隆位點區段，但并未破壞該基因的功能。

pUC系列的多克隆位點一一對應于M13mp系列。PUC系列大多數是成對的，如pUC8/pUC9、pUC18/pUC19，即每對間含有大致相同的多克隆位點（個別切口又可不同），但整個多克隆位點反向倒裝（故稱其為一對）。不同對的pUC系列質粒載體的多克隆位點的數目和種類不同。

與pBR332質粒載體相比，pUC系列具有許多方面的優越性，是目前基因工程研究中最通用的大腸桿菌克隆載體之一。其優點有：①具有更小的分子量和更高的拷貝數，在構建pUC系列時僅保留了pBR332的復制子和Ampr；②適應于組織化學篩選重組體，pUC質粒結構中具有來自大腸桿菌LacZ操縱子的LacZ′基因，其編碼的α-肽鏈可參與α-互補作用。目的基因插入后，破壞LacZ基因的完整性。在重組實驗中，可用異丙基-β-D-硫代半乳糖（IPTC）誘導LacZ基因表達β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，該酶能消化5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖（X-gal）產生藍色產物。若LacZ基因插入失活，則缺乏β-半乳糖苷酶表達，也就不能消化X-gal，菌落為白色即陽性重組體克隆，此稱作藍白斑實驗；③pUC系列的多克隆位點與M13mp系列對應，因此克隆的外源DNA片段就可以在二類載體系列之間來回“穿梭”，這使克隆序列的測序極為方便。