一、目的基因的獲得
目的基因是指所要研究或應用的基因，也就是將要克隆或表達的基因。獲得目的基因是分子克隆過程中最重要的一步。目前用于獲得目的基因的方法有幾種，如限制性內切酶直接分離法、文庫篩選法、體外擴增法和人工合成法等，其中限制性內切酶法直接分離目的基因和多聚酶鏈式反應（PCR）或逆轉錄-多聚酶鏈式反應（RT-PCR）體外擴增目的DNA片段是目前最常用的方法。
（一）采用限制性酶切法直接分離目的基因
1.
從原核基因組中制備 原核基因組相對較小，用幾種限制性內切酶分別消化原核基因組，或用某種限制性內切酶對所要研究的基因組進行部分消化，可以得到大小不等的各種片段，其中有些片段就會含有目的基因，將這些片段插入載體中進行克隆，經過篩選，可以得到所需的目的基因。
2.
從真核基因組中制備 真核基因組比較大，直接用限制性內切酶消化后需要篩選的克隆數太多，不易操作。可以用一種限制性內切酶先消化基因組DNA，產生連續的DNA片段，然后電泳分離這些DNA片段，再用一段特異探針與這些DNA片段進行雜交，在含有特異性模板的區域就會出現雜交帶，可以初步鑒定基因組中是否含有目的基因。我們也可以將酶切后的基因組DNA片段全部克隆入適當的載體中，制成基因組文庫，再用特異性探針與基因組文庫中的不同克隆進行雜交，陽性克隆即表示克隆到的DNA片段含有特異基因序列。將陽性克隆測序，用第一個克隆片段的末端分離下一個克隆片段，然后利用DNA片段間的重疊順序來鑒定其他克隆。這樣一步步走下去，最終可得全部基因序列，這種技術叫做染色體步移（chromosome
walking）。
（二）采用PCR或RT-PCR方法制備目的基因
根據已發表的基因序列設計并合成引物，采用PCR（以基因組DNA為模板）或RT-PCR（以mRNA為模板）從組織或細胞中獲取目的基因片段用于基因操作，這是實驗室中最常用的獲取已知基因的方法。
利用PCR獲取目的基因的一大優點就是可以根據需要在引物序列上設計適當的酶切位點、起始密碼子或終止密碼子等，或通過人為錯配改變堿基序列（人工突變）對目的基因進行有限修飾。對于未知基因，可采取構建RT-PCR文庫的方法獲得未知基因：利用mRNA末端poly
A序列尾設計共用引物，將所有mRNA逆轉錄成cDNA，利用各種工具酶在cDNA末端加尾，然后采用一對共用引物擴增所有cDNA片段，將經PCR擴增后的片段插入到適當載體中，構建成PCR-cDNA文庫。這種方法的優點是可以將表達水平很低的mRNA擴增出來，有利于篩選出表達豐度低的基因。由于經過PCR擴增，基因序列的精確性需要采用其他方法進一步確定。
還有一個獲得目的基因的方法是利用計算機技術進行“計算機克隆”，即利用GenBank中的基因信息，通過軟件比較不同種屬基因之間的相似性（同源性），利用保守區序列設計引物，再用PCR或RT-PCR從不同種屬或不同組織細胞中獲取未知的基因片段。這是目前可實現的一種獲得新基因的捷徑。
（三）基因組文庫或cDNA文庫的構建和篩選
將基因組DNA用限制性內切酶消化后插入到適當載體中，得到含有不同插入片段的克隆載體，這種克隆載體的混合物含有長短不同的基因組片段，這就是基因文庫。若將細胞內所有mRNA均逆轉錄成cDNA，然后將所有cDNA片段克隆到適當的載體中，構建成含有不同cDNA片段的克隆載體混合物，這就是cDNA文庫。目前許多組織或細胞的基因組或cDNA文庫都可以從商業公司買到。
當獲得了基因組文庫或cDNA文庫，可以根據已知的信息合成特異性探針，采用核酸分子雜交的方法從文庫中篩選感興趣的基因片段，這仍是目前獲得新基因的一種常用手段。基因組文庫或cDNA文庫的構建和使用請參見本書相應的章節。
（四）化學合成法制備基因片段
采用DNA合成儀，對目的基因進行分段合成，然后進行連接，可以得到所需的目的基因。化學合成法可以改變原始的基因序列，甚至可以合成自然界不存在的序列。在合成過程中可以根據需要改變核苷酸的密碼子，如將真核基因序列中不易在E.
coli中利用的稀有密碼子改成E. coli偏愛的密碼子，有利于真核基因在E. coli中的表達。