（二）隨機引物合成法
隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探針。合成產物的大小、產量、比活性依賴于反應中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，產物平均長度為400～600個，可以獲得大量的有效探針。反應時對模板的要求不嚴格，用微量制備的質粒DNA模板也可進行反應。反應產物的比活性較高，可達4×109
cpm/μg探針。隨機引物反應還可以在低熔點瓊脂糖中直接進行。
1. 材料
（1）設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
（2）試劑：①隨機引物（隨機六聚體或斷裂的鮭魚精子DNA）。 ②10×隨機標記緩沖液：900mmol/L HEPES
(pH6.6)；10mmol/L MgCl2。③Klenow片段。④20mmol/L
DT。⑤未標記的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。⑥[α-32P]
dATP：比活性3000Ci/mmol，10μCi/μl。 ⑦緩沖液A：50mmol/L Tris·Cl（pH7.5）、50mmol/L
NaCl、5mmol/L EDTA（pH8.0）、0.5% SDS。
2.步驟
（1）200ng雙鏈DNA(1μl)和7.5ng隨機引物(1μl)混合后置于Eppendorf管內，水浴煮沸5min后，立即置于冰浴中1min。
（2）與此同時，盡快在一置于冰浴中的0.5ml Eppendorf管內混合下列化合物：20mmol/L DTT 1μl、未標記的dNTP溶液
1μl、10×隨機標記緩沖液 1μl、[α-32P] dATP(比活性3000Ci/mmol；10μCi/μl) 3μl、ddH2O 1μl。
（3）將步驟(1) Eppendorf管中的溶液移到步驟（2）管中。
（4）加入5U(約1μl) Klenow片段，充分混合，在微型離心機中以12 000g離心1～2s，使所有溶液沉于試管底部，在室溫下保溫3～16h。
（5）在反應液中加入10μl緩沖液A后，將放射性標記的探針保存在-20℃下備用。同時計算放射比活性。
3.注意事項
（1）引物與模板的比例應仔細調整，當引物高于模板時，反應產物比較短，但產物的累積較多；反之，則可獲得較長片段的探針。
（2）模板DNA應是線性的，如為超螺旋DNA，則標記效率不足50%。
（三）光敏生物素標記方法
光敏生物素是一種化學合成的生物素衍生物。其分子中含有可光照活化的疊氨代硝苯基。醋酸鹽易溶于水，在水溶液中光敏生物素醋酸鹽與待標記核酸混合，在強可見光短暫照射下即能與核酸的堿基反應，生成光敏生物素標記核酸探針。一般在規定條件下，核酸中每100～150bp可結合一個生物素。這種生物素標記的探針不會影響探針序列與其互補和新的靶序列之間的雜交。該標記方法的優點是簡便易行，單、雙鏈DNA和RNA都能以此法標記形成穩定的共價結合，且生成的標記探針為橙紅色，便于觀察反應結果。此法標記的探針可檢出0.5pg濾膜結合DNA。此外，標記探針穩定性好，-20℃可保存12個月。
1.材料
（1）儀器 LYQ 12～100鹵鎢燈、臺式離心機。
（2）器皿 微量移液器、Tip頭，光標用冰模、墨鏡、尺子。
（3）試劑 ①光敏生物素醋酸鹽為白色干粉，分子量為533。在暗室中用滅菌雙蒸水溶解，使成1mg/ml。小量分裝，避光下-20℃可穩定保存4～6個月。②仲丁醇或正丁醇。③TE緩沖液100
mmol/L Tris·Cl(pH 9.0)1 mmol/L EDTA。④無水乙醇、70％乙醇。⑤3 mol/L醋酸鈉(pH5.2)。⑥0.1
mmol/L EDTA(pH8.0)或滅菌dH2O。
2．方法
（1）強光源照射標記：在暗室安全燈下，向微量離心管中加入15μg待標記核酸(DNA或RNA)，15μg光敏生物素并混勻。將反應管敞口插入冰模中，液面距光源10cm，用LYQ
12-100鹵鎢燈光照標記30min。加入70μlTE緩沖液。此后操作在正常光線下進行。
（2）仲丁醇提取：加入100μl(等體積)仲丁醇(或正丁醇)，充分混勻，4000g離心2min。吸棄上相，加入等體積仲丁醇(或正丁醇)重復萃取一次。
（3）乙醇沉淀濃縮：吸棄上相，計量下相(溶液可濃縮至40μl左右)。加入1/10體積3mol/L的乙酸鈉(pH5．2)和2倍體積冷無水乙醇，混勻。-20℃沉淀過夜或-70℃沉淀1h以上。以4℃10
000g離心15min。棄上清，再用100μl 70％冷乙醇以4℃ 10 000g離心15min。離心洗滌沉淀(注意勿將沉淀吹散)。
（4）標記核酸的保存：真空干燥或室溫風干標記沉淀物，將其溶于適量0.1 mmol/L EDTA溶液或滅菌雙蒸水中。適量分裝后-20℃避光保存備用。