（三） DNA連接酶的反應條件
影響連接效率的因素有：
1. 溫度（通常在4-15℃ ）
2. ATP的濃度(10μM／L - 1mM／L )
3. 連接酶濃度（一般平末端大約需1～2U，黏性末端僅需0.1U）
4. 反應時間（通常連接過夜）
5. 插入片段和載體片段的摩爾比（ 1∶1～5∶1）
（四）T4 DNA連接酶對目的DNA片段和載體連接的一般方案
1．連接反應一般在滅菌的0.5ml離心管中進行。
2．10μl體積反應體系中：取載體50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數為1∶1～5∶1），補足ddH2O 至8μl。
3．輕輕混勻，稍加離心，56℃水浴5min后，迅速轉入冰浴。
4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA連接酶合適單位， 用ddH2O 補至10μl，稍加離心，在適當溫度（一般14-16℃）連接8-14hr。
三、DNA聚合酶及其應用
（一）大腸桿菌DNA聚合酶I
是Kornberg A. 1956年首先從大腸桿菌E。Coli 細胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括 3種不同的酶活力：
5′→ 3′聚合酶活性（模板， 帶3′－OH游離基團的引物、4dNTPs、 Mg2+ ）。
雙鏈特異性的5'→3'核酸外切酶活性。
3'→5'核酸外切酶活性。
從游離的雙鏈或單鏈DNA的3′端降解。不過對于雙鏈的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。主要是校正作用。
大腸桿菌DNA聚合酶I 的三種用途
1.利用缺口轉移法制備高比活度的DNA探針
利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。
2.用于DNA連接前的大缺口填充
利用5′--3′的聚合酶活性。
3.用于DNA的序列分析
利用5′--3′的聚合酶活性。
（二）Klenow片段酶
Klenow片段是大腸桿菌聚合酶 I 全酶經枯草桿菌蛋白酶處理后產生的大片段酶分子，分子量為76KD 。
酶催活性：⑴5’ →3’ 的聚合酶活性
⑵3’ →5’ 的核酸外切酶活性
Klenow片段的主要用途（利用5’ →3’ 的聚合酶活性）：
⑴修補限制性酶消化DNA形成的3′隱蔽末端
⑵標記DNA片段的末端
底物用［α－32P］－dNTPs
⑶cDNA克隆中第二鏈cDNA的合成
⑷DNA序列的測定
