說起免疫印跡（Western Blot）檢測，想必大家都很熟悉了，不就是WB嗎？每天都做啊，白底黑帶，但是最近經常閱讀SCI文獻（特別是高分的）小伙伴可能會發現，近兩年發表很多高影響因子的文獻的WB結果圖發生了大變樣：白底變成了黑底，條帶從黑色變成了：紅，橙，黃，綠，藍等各種顏色了（如下），條帶亮度，對比度都好了很多了，不同蛋白還能呈現出不同顏色的條帶，很多同學可能會問，這是什么黑科技？是用分析軟件設置的顏色嗎？還是PS軟件P出來的了？
其實都不是，這是最近比較火的免疫印跡黑科技——熒光WB技術，這不，很多同學還在實驗室中苦逼的跑著WB，“為啥背景那么深？為啥沒有目的條帶？為啥分子量不對？為什么對比度這么低？哀怨聲此起彼伏的時候，殊不知，免疫印跡領域已經發生著一場由“黑白”到“彩色”的光影革命。
熒光WB產生背景：
盡管大多數生命科學研究者采用化學發光底物進行檢測，但由于對多重分析的需求不斷增加，現在越來越多的國外科學家開始使用熒光檢測法。目前國內實驗室使用較多的仍是化學發光，而SCI期刊中則有很多已經使用熒光標記WB了，為了緊跟時代的步伐，我們需要引進和創新。
常見Western Blot顯色的方法主要有：放射自顯影、底物化學發光ECL、底物DAB呈色，熒光WB實驗步驟跟傳統WB差異不大，最主要的差別在于二抗：傳統WB檢測二抗是酶標記，而熒光WB的二抗是熒光標記的，省去了繁雜的顯影，照膠等步驟，取而代之的是利用熒光成像儀直接成像。
常規WB和熒光WB原理對比
說了這么多，那熒光ＷＢ到底好在哪了？
熒光WB的優勢：
化學發光的信號是動態的，二抗是酶標記，屬于酶促動力學反應，信號隨時間的變化而變化，信號不與目標蛋白濃度成線性比例關系。而熒光信號熒光是靜態信號，不會隨著時間的變化而變化，信號持久，可達到精準定量。
1.靈敏度更高
熒光免疫印跡已被證明比傳統化學發光印跡更敏感，這是因為IR區域膜上的低背景熒光產生高的信噪比。配備有光電倍增管（PMT）的激光掃描成像儀對印跡進行成像，并可以將弱信號放大幾個數量級。
2.通過復用提高量化精度
使用雙色檢測方法可以同時檢測相同印跡上的兩種抗原。例如，您可以分析您感興趣的蛋白，并利用內參蛋白（例如GAPDH，肌動蛋白）將其均一化，而無需剝離/重新檢測印跡或運行單獨的凝膠。因此，您的量化將更準確。
雙色檢測
3.廣泛的線性動態范圍用于定量測量
為了確保可靠的定量測量，您從western blot獲得的信號必須在線性動態范圍內。這意味著信號強度與目標蛋白質豐度呈線性相關。換句話說，信號強度的兩倍增加意味著目標蛋白質水平增加了兩倍。通過激光成像儀獲得的靜態熒光值是定量的。這是因為熒光強度與幾個數量級的蛋白質豐度成正比。這提供了廣泛的線性范圍。您可以在相同設置下量化低豐度和高豐度蛋白質，而不用擔心信號飽和或超出線性范圍。
相比之下，X射線膠片的動力學酶-底物反應和信號飽和將化學發光檢測的線性度限制在更小的范圍內。您經常需要嘗試各種曝光以獲得差異表達蛋白質的“正確圖像”。這是為了確保捕獲的信號在線性范圍內。