為什么咪唑可以把鎳柱上的組氨酸蛋白洗脫下來?(1) 發布時間：2018-11-09 蛋白純化 分子篩。 隨著分子生物學的發展，越來越多的科研人員熟練掌握了分子生物學的各種試驗技術，并研制成套試劑盒，使基因克隆表達變得越來越容易。但分子生物學的上游工作往往并非是最終目的，分子克隆與表達的關鍵是要拿到純的表達產物，以研究其生物學作用，或者大量生產出可用于疾病治療的生物制品。相對與上游工作來說，分子克隆的下游工作顯得更難，蛋白純化工作非常復雜，除了要保證純度外，蛋白產品還必須保持其生物學活性。純化工藝必須能夠每次都能產生相同數量和質量的蛋白，重復性良好。這就要求應用適應性非常強的方法而不是用能得到純蛋白的最好方法去純化蛋白。在實驗室條件下的好方法卻可能在大規模生產應用中失敗，因為后者要求規模化，且在每日的應用中要有很好的重復性。本文綜述了蛋白質純化的基本原則和各種蛋白純化技術的原理、優點及局限性，以期對蛋白純化的方法選擇及整體方案的制定提供一定的指導。 1 蛋白純化的一般原則 蛋白純化要利用不同蛋白間內在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質的污染，而利用各蛋白質的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學活性都會有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來得到重組蛋白。蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細純化階段二個階段。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細胞成分如DNA、RNA等分開，由于此時樣本體積大、成分雜，要求所用的樹脂高容量、高流速，顆粒大、粒徑分布寬.并可以迅速將蛋白與污染物分開，防止目的蛋白被降解。精細純化階段則需要更高的分辨率，此階段是要把目的蛋白與那些大小及理化性質接近的蛋白區分開來，要用更小的樹脂顆粒以提高分辨純化的*步，它可以初步粗提蛋白質，去除非蛋白成分。蛋白質在硫酸銨沉淀中較穩定，可以短期在這種狀態下保存中間產物，當前蛋白質純化多采用這種辦法進行粗分離翻。在規模化生產上硫酸銨沉淀方法仍存在一些問題，硫酸銨對不銹鋼器具的腐蝕性很強。其他的鹽如硫酸鈉不存在這種問題，但其純化效果不如硫酸銨。除了鹽析外蛋白還可以用多聚物如PEG和防凍劑沉淀出來，PEG是一種惰性物質，同硫酸銨一樣對蛋白有穩定效果，在緩慢攪拌下逐漸提高冷的蛋白溶液中的PEG濃度，蛋白沉淀可通過離心或過濾獲得，蛋白可在這種狀態下長期保存而不損壞。 蛋白沉淀對蛋白純化來說并不是多么好的方法，因為它只能達到幾倍的純化效果，而我們在達到目的前需要上千倍的純化。其好處是可以把蛋白從混雜有蛋白酶和其他有害雜質的培養基及細胞裂解物中解脫出來。 重組蛋白純化濃度一般多大。蛋白純化 分子篩。 2 緩沖液的更換 雖然更換緩沖液不能提高蛋白純度，但它卻在蛋白純化方案中起著極其重要的作用。不同的蛋白純化方法需要不同pH及不同離子強度的緩沖液。假如你用硫酸銨將蛋白沉淀出來，毫無疑問蛋白是處在高鹽環境中，需要想辦法脫鹽，可用的方法有利用半透膜透析，通過勤換透析液體去除鹽分，此法尚可，但需幾個小時，通常要過夜，也難以用予大規模純化中。新型的設備將透析膜夾在兩個板中間，板的一側加緩沖液，另一側加需脫鹽的蛋白溶液，并在蛋白溶液一側通過泵加壓，可以使兩側溶液在數小時內達到平衡，若增加對蛋白溶液的壓力，還可迫使水分和鹽更多通過透析膜進入透析液達到對蛋白濃縮的目的。也有出售的脫鹽柱，柱內的填料是小孔徑的顆粒，蛋白分子不能進入孔內，先于高濃度鹽離子從柱中流出，從而使二者分離。蛋白純化的每一步都會造成目的蛋白的丟失，緩沖液平衡的步驟尤甚。蛋白會結合在任何它能接觸的表面上，剪切力、起泡沫和離子強度的快速變化很容易讓蛋白失活。 3 離子交換色譜 這是在所有的蛋白純化與濃縮方法中最有效方法。基于蛋白與離子交換樹脂間的相互電荷作用，通過選擇不同的緩沖液，同一種蛋白既可以和陰離子交換樹脂(能結合帶負電荷的分子)結合，也可以和陽離子交換樹脂結合。樹脂所用的帶電基團有四種：二乙基氨基乙基用于弱的陰離子交換樹脂;羧甲基用于弱的陽離子交換樹脂;季銨用于強陰離子交換樹脂;甲基磺酸酯用于強陽離子交換樹脂。蛋白質由氨基酸組成，氨基酸在不同的pH環境中所帶總電荷不同。大多數蛋白在生理pH(pH 6—8)下帶負電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的pH下蛋白會變性失活.應盡量避免。由于在某個特定的pH下不同的蛋白所帶電荷數不同，與樹脂的結合力也不同，隨著緩沖液中鹽濃度的增加或pH的變化，蛋白按結合力的強弱被依次洗脫 。在工業化生產中更多地是改變鹽濃度而不是去改變pH值，因為前者更容易控制 。在實驗室中幾乎總是用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩地上升，當離子強度能夠中和蛋白的電荷時，蛋白就被從柱上洗脫下來。但在工業生產中鹽濃度很難精確控制，所以常用分步洗脫而不足連續升高的鹽梯度。與排阻層析相比，離子交換特異性更好，有更多的參數可以調整以獲得最優的純化效果，樹脂也比較便宜。值得一提的是，即便是用最精確控制的條件，僅用離子交換單一的方法也得不到純的蛋白，還需要其他的純化步驟。 重組蛋白純化濃度一般多大。