關于淘汰尿妊娠蟾蜍試驗
淘汰尿妊娠蟾蜍試驗及其替代項目
妊娠試驗是臨床檢驗工作中最常應用的檢驗項目之一，視代醫學用實驗室方法進行妊娠診斷已有六十多年的歷史。從方法學進展分析，大致經歷了三個階段。1928年德國醫師Aschkeim等以孕婦尿注入未熟的小白鼠皮下，第五天解剖觀察其卵巢，發現有充血、濾泡形成、出血點及黃體，即表示妊娠皮應陽性。此法用于臨床診斷，標志著第一階段，即生物學妊娠診斷階段的開始。在50年代，“青蛙”實驗已成為診斷妊娠的重要常規實驗手段。第二階段是通過生物化學實驗(如碘實驗)進行妊娠的診斷。
基礎醫學的研究，發現以上這些實驗都是由于孕婦尿中存在較多量的絨毛膜促性腺激素(HCG)，注射到動物體內而引起的生物效應。因此，研究的焦點放在如何通過尿中HCG的檢測進行更靈敏的妊娠診斷，這是妊娠診斷的第三階段。1960年Wide首先報告了免疫學測定法，標志著一般免疫學逆方法診斷妊娠階段的開始。其后，此法發展很快，并不斷改進。礦它簡單、快速，迄今仍是我國常規檢驗中的主要方法。隨著免疫學的進展，并為滿足臨床醫療及計劃生育工作的需要，更靈蔽敷的免疫學方法已應用于HCG檢測。80年代以來，放射免疫，單克隆抗體二點酶聯免疫測定法相繼問世，HCG檢測水平達到501U／L以下，使實驗方法進入了早早孕階段。
淘汰雄蟾蜍或雄蛙試驗的原因
妊娠婦女胎盤絨毛產生大量的HCG，釋放入血，使血液中濃度升高。HCG的分子量較小(50000)，可通過腎小球從尿中排出。將可疑妊娠婦女的尿注入雄蟾蜍體內，尿中如含有大量的HCG，則可刺激該動物的間質細胞產生雄性激素，放出精子。幾小時后，檢查動物排泄物中有無精子。有精子即為妊娠試驗陽性，否則為阻性。
青蛙實驗雖取材容易，尤其適用于農村等基層醫療單位的使用，但也存在許多不足。①敏感性差，其檢測HCG靈敏度僅為30001U／L。②動物的個體差異、動物本身強弱的程度、動物飼養的環境不同，實驗環境以及實驗溫度(室溫)均影響反應速度，造成假陰性結果。⑧實驗手續繁雜，實驗時間長達4至24小時。④過堿尿液可使動物致死，實驗前要糾正尿液pH值。鑒于上述缺點，1991年衛生部18號令決定在我國廢除該項實驗。
替代的方法
一、膠乳凝集抑制試驗(LAI試驗)
（一）原理
HCG是一種糖蛋白，作為抗原注入家兔體內，可使其產生相應抗體(抗HCG血清)。當這種抗體與抗原扣遇時即可產生免疫反應，但這種反應不能為肉眼所見。用化學方法將HCG交聯在聚苯乙烯膠乳顆粒上，成為HCG膠乳抗原。當此抗原與抗HCG抗體結合時，就能見到膠乳顆粒的凝集。
孕婦尿中HCG含量增高，與相應量的抗血清(HCG)抗體充分作用后，因抗體已被結合，再加入HCG膠乳后，本該凝集的試驗受到抑制，則不發生凝集反應，仍呈均勻乳狀液。說明尿中HCG含量高，為妊娠免疫試驗陽性。非孕婦尿中因含HCG極低，不足與抗HCG血清完全作用，故當加入HCG膠乳時，則可發生特異性凝集反應，成顆粒狀沉淀。說明尿中HCG含量少，為妊娠免疫試驗陰性。
（二）試劑與器材?
１、妊娠診斷膠乳抗原? 呈均勻乳濁的外觀(系吸附有絨毛膜促性腺激素的聚苯乙烯膠乳抗原)，用前搖勻。
２、妊娠診斷抗血清? 用HCG免疫家兔獲得。
３、反應板? 系背面涂以黑漆，正面用紅漆劃分為若干個2．5×2．5cm方格的玻璃板。亦可用普通載玻片代替。
（三）操作
１、在特制黑色玻璃板的一個實驗圈內，滴加被檢尿一滴。
２、加抗HCG血清一滴，搖動玻片，充分混合30秒鐘，促使抗HCG血清與尿中HCG抗原充分結合。
３、放置2～3分鐘，再滴加膠乳抗原一滴，繼續不斷緩慢播動玻片2～3分鐘。
４、在光線較強處的黑色背景下用肉眼觀察結果，如不明顯時亦可用顯微鏡觀察。
（四）結果判斷
如玻片內液體呈均勻乳狀，混濁不透明，為無凝集現象，即妊娠試驗陽性。如玻片內液體呈顆粒樣凝集，且液體的均勻乳濁狀態消失而有透明感，即為妊娠試驗陰性反應。若出現非均勻——致的漂浮凝集為非特異性凝集，應將標本離心后重試，并查清原因。
（五）注意事項
應用清晨第一次尿，并要求標本新鮮，透明。
所用的膠乳抗原和抗血清必須是同一批號。更換試劑時必須與上一批試劑作陽性和陰性對照，其結果一致時方可采用。
尿液，抗血清和抗原，一定要按規定順序加入，滴的大小要一致。
室溫20℃時反應較好，溫度太低反應緩慢，觀察結果應延長1～5分鐘。
嚴重蛋白尿、血尿、尿液含多量汞鹽及嚴重細菌污染，均不宜作此試驗。
試劑應保存于2℃～8℃冰箱。試驗前先取出於室溫放置，待其溫度接近室溫后再使用。注意不能再凝集。
每次試驗均應作已知陽性，陰性和鹽水對照，完全符合才能報告結果。
二、單克隆抗體二點酶免疫法
本法使用的試劑與器材有單克隆HCG酶結合抗體顯色劑、聚苯乙烯小孔板。試驗時在聚苯乙烯小孔板的小孔中加酶結合抗體溶液1滴，再立如加尿液標本1滴，混勻后置37℃20分鐘，倒出小孔中溶液，用自來水洗滌6次，以紗布吸干。加顯色劑2滴，5分鐘后觀察結果；顯藍色為陽性，無色為陰性。
此法測定的基本原理是在已包被有抗β-HCG抗體塑料小孔中，加入將酶標記抗α-HCG抗體及被測尿標本，如尿中含有HCG，其兩端分別與以上抗α及β-HCG抗體結合，遇底物后結合于HCG上的抗體，酶促使底物顯色。標本中若無HCG存在，就不能與單克隆抗體酶結合，在滌洗過程中即被洗脫。
單克隆抗體二點酶免疫法由于采用了一對HCG特異性抗體，所以特異性強，與HCG的同類激素如促甲狀腺激素(TST)、促卵泡或熟激素(FSH)及促黃體生成激素(FSH)等無交叉反應。也不受尿中高蛋白，血液，高藥物濃度的影響。而且敏感性高，在尿中含有，50 IU／L時即出現陽性反應。此濃度相當于受孕10天時孕婦尿中HCG之含量，故本法又被稱為“早早孕試驗”。由此可以看出，此法是很有前途的HCG檢測方法。
三、酶聯免疫測定法
此法與目前國內普遍采用的試劑盒不同點在于其設計，結構及選取的材料。該試劑反應體為一試管，試管頂端有兩層膜。第一層為保護性濾膜，其作用可將尿液中蛋白雜質濾除。第二層為一張經抗一HCG抗體處理的反應膜。試管內充填優質吸附材料，可吸收過濾的尿液或血清樣品。該試劑盒配備有下種試劑：試劑1為單克降抗β-HCG＋辣根過氧化物酶復合物；試劑2為酶的底物顯色液。當尿液樣品通過上層濾膜時，尿液中的抗HCG分子便可與膜上的抗一HCG抗體結合，加入試劑1后，抗體酶復合物通過濾膜和反應膜與膜表面上的HCG分子上的另一個暴露點呈特異性的結合。此時將濾膜剝開，加入試劑2使復合物著色，根據尿樣中HCG值不等而m速顯示出不同的顏色符號。該法的另一優點是，處理的膜上含有特殊形狀的HCG帶，作為檢查實驗中酶系統反應情況的標志，對控制結果的質量有重要作用。當抗體酶復合物或顯色劑失效時，反應物不出現任何標記(點和杠均不出現)。有文獻報告，此法靈敏度較高，準確性也很好，是開展檢測早早孕、藥物引產、人工流產理想的檢測試劑。
RIA定量測定：如欲測得精確HCG定量結果，則需采用放射免疫(R1A)測定法。具體方法讀者可參閱其他有關文獻或著作。
四、妊娠實驗的臨床應用及方法選擇
絨毛膜促性腺激素(HCG)的檢測不僅對妊娠的診斷具有重要意義，而且對與妊娠相關疾病的診斷、鑒別和臨床觀察也具有十分重要的價值。
（一）在妊娠診斷方面的應用
１、首先，是用于早期診斷妊娠。妊娠時尿中HCG含量增高，一般孕后35～40天在25000IU／L以上，60，70天出現高峰，可達8000～320000IU／L，個別人甚至高至百萬單位以上。常用HCG檢測方法均能在妊娠35天時呈現陽性反應，陽性率達98%以上。一些靈敏度高的試驗則可在更早期做出診斷。
２、有利于非計劃妊娠的處理。使用酶聯或RIA等方法可測出25天以內的早早孕。及時給予口服抗早孕藥物再定期觀察，若抗治無效，即可做人工流產。
３、對異常妊娠及妊娠有關情況的觀察。宮外孕時，一般試驗有60％的陽性率(子宮流血3天后仍可見血中HCG增高)，此點有助于與其他急腹癥的鑒別。不完全流產者子宮內尚有胎盤組織存活時，妊娠試驗仍可呈陽性。完全流產或死胎，可由陽性轉為陰性。HCG在2500IU／L以下的孕婦，并有逐漸下降的趨勢者，有流產或胎兒死亡的可能。當HCG降到600IU／L時則難免流產。在保胎治療中，如尿HCG不斷下降，表示保胎無效，反之如明顯上升，說明保胎是成功的。在正常產后4天或人工流產后13天，血清HCG應低于1000IU／L；產后9天或人工流產后25天，血清HCG應恢復正常。否則，應考慮有異常可能。先兆流產時，尿中HCG含量正常則可不發生流產，即預后良好；如HCG低于1000IU／L，則發生流產的可能性大，治療往往無效。多胎妊娠時，血及尿中HCG含量往往高于正常一胎妊娠。
４、可做為判定胎盤功能的依據。正常妊娠期，血清中HCG的變化呈雙峰曲線，第一峰在妊娠?0天左右(80000IU／L)，100天后漸呈下降趨勢，140～200天維持在低而穩的水平(6000～20001U／L)，至260天又出現第二高峰(26000IU／L，臨產期又稍有下降。此種變化反映出正常妊娠時的胎盤功能狀態。若在第一高峰期做血清HCG測定，其值在正常范周內，79％可妊娠足月，若低于正常范圍，92％的妊娠失敗。
（二）在滋養細胞腫瘤診療方面的應用
葡萄胎、惡性葡萄胎、絨毛膜癌及睪丸畸胎瘤等疾病的患者，尿中HCG顯著增高，可達每升10萬至數百萬單位。應用稀釋試驗診斷可與正常妊娠鑒別。正常妊娠尿液一般經l：100稀釋后即呈陰性反應，葡萄胎在1：200以上，稀釋后常常仍為陽性。一般認為在妊娠12周以前，如稀釋1：500仍呈陽性，妊娠12周以后稀釋1：200以上仍呈陽性，則具有診斷價值。絨毛膜上皮癌等惡性腫瘤的分化程度不同，尿液HCG含量可相差較大，一般經l；100～1，500稀釋仍呈陽性者，結合臨床可做出診斷。在這些疾病手術或藥物治療后需連續進行尿液HCG測定，借以判斷療效，觀察病情變化。滋養細胞腫瘤病人術后3周，尿中HCG應低于501U／L；8～12周應呈陰性。如仍呈陽性則揭示可能有殘存瘤組織，潛在復發趨向，更需定期檢查。葡萄胎應半年后檢查一次；絨毛膜癌術后1—3個月檢查一次，以后每半年復查一次(均用濃縮試驗法)，以便及時發現惡變復發，利于及早治療。
表1 幾種檢測HCG方法的比較
名稱及縮寫符號 | 靈敏度(IU/L) | 實驗條件 | 應用價值 |
膠乳凝集抑制試驗(LAT) | 2500 | 試劑易購得,方法簡便,5min可完成 | 用于早孕診斷適合于一般醫院廣泛使用 |
紅細胞凝集抑制試驗(HAL) | 半定量1000 | 要求條件較高，需2h完成 | 使用于有條件的醫院或一般科研應用 |
放射免疫試驗（RIA） | 15 | 要求條件高1h可完成試驗 | 同上 |
單克隆抗體體二點酶免疫法（β—HCG）又稱早早孕試驗 | 50 | 試劑要求條件高，1h可完成試驗 | 適合做高靈敏度、特異性的檢測，可與LH鑒別 |
上述有關HCG在臨床中的應用，有的只是一般的定性實驗，有的則要參考準確的HCG含量。臨床醫生可根據木同的實驗目的，有的放矢地選擇。幾種HCG檢測法特點見表1。