第三節操作步驟
一、細菌的培養和收集
將含有質粒pBS 的DH5α菌種接種在LB 固體培養基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培養12-24 小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB 液體培養基(含50μg/ml Amp)中,37℃振蕩培養約12 小時至對數生長后期。
二、質粒DNA 少量快速提取
質粒DNA 小量提取法對于從大量轉化子中制備少量部分純化的質粒DNA 十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣,所得DNA 有一定純度,可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。
（一）、煮沸法
1、將1.5ml 培養液倒入eppendorf 管中,4℃下12000ｇ離心30 秒。
2、棄上清，將管倒置于衛生紙上幾分鐘，使液體流盡。
3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET 溶液中, 渦旋混勻。
4、加入10ml 新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 渦旋振蕩3 秒鐘。
5、將eppendorf 管放入沸水浴中,50 秒后立即取出。
6、用微量離心機4℃下12000g 離心10 分鐘。
7、用無菌牙簽從eppendorf 管中去除細菌碎片。
8、取20ml 進行電泳檢查。
[注意] 1. 對大腸桿菌可從固體培養基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質粒DNA。
2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時,細菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。
3. 提取的質粒DNA 中會含有RNA,但RNA 并不干擾進一步實驗,如限制性內切酶消化,亞克隆及連接反應等。
（二）、堿法
1、取1.5ml 培養液倒入1.5ml eppendorf 管中,4℃下12000g 離心30 秒。
2、棄上清,將管倒置于衛生紙上數分鐘,使液體流盡。
3、菌體沉淀重懸浮于100μl 溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10 分鐘。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf 管數次,以混勻內容物(千萬不要振蕩),冰浴5 分鐘。
5、加入150μl 預冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10 秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g 離心5-10 分鐘。
6、上清液移入干凈eppendorf 管中,加入等體積的酚/氯仿(1:1),振蕩混勻,4℃下12000g 離心5分鐘。
7、將水相移入干凈eppendorf 管中,加入2 倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g 離心10 分鐘。
8、棄上清,將管口敞開倒置于衛生紙上使所有液體流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g 離心5-10 分鐘。
9、吸除上清液,將管倒置于衛生紙上使液體流盡,真空干燥10 分鐘或室溫干燥。
10、將沉淀溶于20μl TE 緩沖液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，儲于-20℃冰箱中。
[注意] 1. 提取過程應盡量保持低溫。
2. 提取質粒DNA 過程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好,要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。
3. 沉淀DNA 通常使用冰乙醇,在低溫條件下放置時間稍長可使DNA 沉淀完全。沉淀DNA 也可用異丙醇(一般使用等體積),且沉淀完全,速度快,但常把鹽沉淀下來,所以多數還是用乙醇。
（三）、Wizard 少量DNA 純化系統
Promega 公司的Wizard 少量DNA 純化系統可快速有效的抽提質粒DNA,整個過程只需15 分鐘。提取的質粒可直接用于DNA 測序、酶切分析和體外轉錄等。
該系統中所含試劑和柱子可以用于50
次1-3ml 質粒培養液的分離和純化，試劑包括10ml 細胞懸浮液，10ml 細胞裂解液；10ml 中和液，50ml Wizard 少量DNA
純化樹脂，50ml 柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml )和50 支Wizard 微型柱。
1、1-3ml 過夜培養細胞液4℃下12000g 離心1-2 分鐘。
2、去除上清液，菌體細胞懸浮于200μl 細胞懸浮液中,充分混合,并移入eppendorf 管中。
3、加200μl 細胞裂解液, 顛倒離心管數次,直到溶液變清亮。
4、加200μl 中和液,顛倒離心管數次。
5、4℃下12000g 離心5 分鐘，取上清液于新的eppendorf 管中。
6、加1ml Wizard 少量DNA 純化樹脂,顛倒離心管數次以充分混勻。
7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒與Wizard 微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進入微型柱。
8、將注射器與微型柱分開,取出注塞, 再將注射筒與微型柱相連,加入2ml 柱洗液,并用注塞輕推，使柱洗液進入微型柱。
9、取出微型柱置于eppendorf 管中,離心2 分鐘以除去微型柱中的柱洗液。
10、將微型柱放在一個新eppendorf 管中，加50μl TE(或水)于微型柱中，靜止1 分鐘后，4℃下12000g 離心20 秒。
11、丟棄微型柱，將eppendorf 管中的質粒DNA 貯于4℃或-20℃冰箱。
[注意] 樹脂使用前應充分混勻,如有結晶,可將樹脂用25-37℃水浴處理10 分鐘。
三、質粒DNA 的大量提取和純化
在制作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質粒DNA,為此需要大量提取質粒DNA。大量提取的質粒DNA 一般需進一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。
（一）、堿法
1、取培養至對數生長后期的含pBS 質粒的細菌培養液250ml，4℃下5000g 離心15 分鐘,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。
2、將細菌沉淀重新懸浮于50ml 用冰預冷的STE 中（此步可省略）。
3、同步驟1 方法離心以收集細菌細胞。
4、將細菌沉淀物重新懸浮于5ml 溶液I 中,充分懸浮菌體細胞。
5、加入12ml 新配制的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數次,以充分混勻內容物,冰浴10 分鐘。
6、加9ml 用冰預冷的溶液III, 搖動離心管數次以混勻內容物,冰上放置15 分鐘,此時應形成白色絮狀沉淀。
7、4℃下5000g 離心15 分鐘。
8、取上清液,加入50ml RNA 酶A(10mg/ml), 37℃水浴20 分鐘。
9、加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g 離心10 分鐘。
10、取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻,4℃下12000g 離心10 分鐘。
11、取上層水相,加入1/5 體積的4mol/L NaCl 和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60 分鐘。
12、4℃下12000g 離心15 分鐘, 沉淀用數ml 70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g 離心5 分鐘。
13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE 或水中。
[注意] 1. 提取過程中應盡量保持低溫。
2. 加入溶液II 和溶液III 后操作應混和,切忌劇烈振蕩。
3. 由于RNA 酶A 中常存在有DNA 酶,利用RNA 酶耐熱的特性,使用時應先對該酶液進行熱處理(80℃ 1 小時),使DNA 酶失活。
（二）、Wazard 大量DNA 純化系統
堿法大量提取DNA
往往需要很長的時間.Promega 公司的Wiazrd 大量DNA 純化系統既簡單又快速,只需要離心和真空抽干,這個系統可以從500ml
培養液中在3 小時以內獲得1mg 以上的高質量的質粒DNA(200-20000bp)。該系統不需要酚和氯仿抽提,純化后的DNA 溶于水或TE
緩沖液中，不含任何鹽份，可以直接用于DNA 序列分析和酶切反應，也可以用于在核酸酶抑制劑（如RNasin）存在的條件下進行體外轉錄反應等。
該系統中含有的試劑和柱子可以用于10
次100-500ml 質粒培養液的分離和純化,試劑包括: 150ml 細胞懸浮液，150ml 細胞裂解液，150ml 中和液，100ml
Wizard 大量DNA 純化樹脂，125ml Wizard柱子洗脫溶液和10 支Wizard 帶有存儲離心管的柱子。
1、100-500ml 細胞培養液置離心管中, 22-25℃下5000g 離心10 分鐘, 所得細胞沉淀充分懸浮于細胞懸浮液中。
2、加15ml 細胞裂解溶液并輕輕混合,可以反復倒置混合,但不能用渦旋振蕩,細胞裂解完全時,溶液會變清,這一步需要20 分鐘。
3、加15ml 中和溶液,立即反復倒置離心管數次，并使之混勻。
4、14000g,22-25℃離心15 分鐘。
5、小心地將上清液吸出并移至一個新離心管中。
6、加0.5 倍體積的異丙醇,混合均勻, 14000g 22-25℃下離心15 分鐘。
7、棄上清,懸浮DNA 沉淀于2ml TE 緩沖液中。這一步中也許有的沉淀不能溶解。
8、加10ml Wizard 大量DNA 純化樹脂溶液, 并渦旋混合。
9、每一個樣品,使用一支Wizard 大量柱子,柱子的頭插在真空器上(Promega 產品,與此配套)。
10、將樹脂/DNA 混合液轉入柱子中,真空抽取樹脂/DNA 混合液。
11、將樹脂/DNA 混合液抽干后,加13ml 柱子洗脫溶液至離心管中, 對管底部的樹脂/DNA 進行洗脫(柱子一邊旋轉一邊加入洗脫液)，并加入柱子中。
12、真空抽干所加入的洗脫。
13、再加12ml 柱子洗脫液進柱子并抽干。
14、加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的樹脂, 柱子真空抽干后將柱子放入用戶提供的離心管中,2500rpm(1300g)離心5 分鐘。
15、取出柱子，真空抽干5 分鐘,再將柱子放入系統中所提供的離心管中，2500rpm(1300g)離心5 分鐘。
16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃預熱過的滅菌重蒸水或TE,1 分鐘后2500rpm(1300g)離心柱子/離心管5 分鐘。
17、取出柱子,離心管中溶液即為提取的質粒DNA,可以直接放在離心管中,蓋上蓋子，儲存在4℃或-20℃備用。
[注意] 1. 在使用之前,系統所提供的柱子洗脫液按1:1 加入125ml 95％乙醇。
2. 純化樹脂必須混勻后再用.
（三）、Sephrose 2B 柱純化質粒DNA
堿法提取的質粒DNA
即使用RNA 酶處理,仍會含有少量RNA。當有些試驗需無RNA 污染的DNA制品時,則需進行進一步純化。一般常用Sepharose 2B
或Sepharose 4B 進行純化,該方法具有快速,條件溫和,重復性好,載體物質可以再利用等優點,因而已廣泛用于質粒DNA 純化。
1、將Sepharose 2B 經含0.1% SDS 的TE（pH8.0）平衡后上柱。
2、將至多1ml 的DNA 溶液鋪在Sepharase 2B 柱上。
3、待DNA 溶液完全進入柱內后立即在柱的上部連接含有0.1% SDS 的TE(pH8.0)貯液瓶。
4、以1ml 流出液為1 份進行收集。
5、對每一管測定其OD260 值,以確定哪些管中含有質粒DNA。通常質粒DNA 在柱上流出的第一個峰中。
6、合并所有含質粒的洗脫液,用等體積的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g 離心2 分鐘,將上層水相轉入新管。
7、加入2 倍體積的冰冷無水乙醇，-20℃下沉淀10 分鐘,然后4℃下12000g 離心10 分鐘,棄去上清液。
8、沉淀加70%乙醇洗滌,4℃下12000g 離心10 分鐘,棄去上清液。
9、沉淀真空抽干,重新溶于TE 或無菌水中。
[注意] 在裝柱過程中,要防止柱床中出現斷裂或氣泡現象,要使界面保持平整。對新裝成的柱,應用含0.1% SDS 的TE 平衡, 以使柱內的凝膠均勻。
思考題
1. 質粒的基本性質有哪些？
2. 質粒載體與天然質粒相比有哪些改進？
3. 在堿法提取質粒DNA 操作過程中應注意哪些問題？