結核分枝桿菌鑒定方法

1.1 萋尼氏抗酸染色痰涂片顯微鏡檢查

 目前萋尼氏抗酸染色痰涂片顯微鏡檢查是我國結核病實驗室使用最為 普遍的方法，其操作簡單快捷，特異性高，設備要求低，但是靈敏度較低，不能及時發現病人。

1.2 發光二極管熒光顯微鏡（LED熒光顯微鏡）

發光二極管熒光顯微鏡管利用二極管光源，延長了顯微鏡使用壽命，不需要暗室，且價格低廉，可以提高涂片的陽性檢出率。目前在國內應用評估結果顯示靈敏度較明場顯微鏡明顯提高，已在部分區縣開始使用。

1.3 交叉引物恒溫擴增結核病診斷技術

在恒定溫度下，特殊的引物和特異性探針在酶的作用下，反應體系在一個密閉的反應管內反應。擴增反應一般不超過一個小時，最短半小時。目前應用玻璃化試劑，穩定性好，便于運輸。目前在國內區縣級應用評估。

1.4 夾層杯結核病診斷方法

將痰標本（或其它標本）用專用消化滅活液充分消化，完全暴露并保留抗酸桿菌，通過自動離心涂片機（或半自動制片染色機）對消化后的標本進行充分集菌。直接在夾層杯裝置中進行抗酸染色，取出基片或膜片置于普通顯微鏡進行觀察。

夾層杯法操作方便快捷，便于標準化操作，通過消化滅活，安全性改善，陽性檢出率也比直接涂片法大大提高。

夾層杯的裝置有沉降式和慮過式，適用于不同工作量的醫療機構。

1.5 環介導等溫擴增

方法采用2對引物在等溫條件下即可完成DNA的擴增，擴增結果通過肉眼觀察熒光進行判定，診斷是否為結核病。同時整個反應體系采用封閉系統減少了工作區域擴增子的污染，整個反應過程只需一個小時即可完成，通過肉眼觀察熒光判讀結果。

2．結核分枝桿菌培養方法

2.1 固體培養

培養是結核病診斷的精標準，也是獲得分離菌株開展耐藥檢測的前提，我國結核病實驗室最常用的是固體羅氏培養法，包括簡單法和中和離心法。

雖然培養是診斷的精標準，但是花費時間長，需要4-8周時間。

2.2 液體培養

液體培養通過添加生長刺激劑，改變檢測方法提高檢測靈敏度等方式縮短了陽性報告時間。

目前應用的有BACTEC-快培、MGIT-快培和Alert 3D-快培法，雖然快速液體培養法縮短了報告時間，但是其價格昂貴且污染率高，限制了其廣泛應用。目前國內應用主要集中在結核病專科醫院。

3．藥物敏感性試驗

3.1 固體藥物敏感性試驗

藥物敏感性試驗是耐藥結核病診斷的主要依據，在規范化治療治療中起著重要作用，不僅有助于篩選有效的抗結核藥物，還可以了解耐藥菌株的流行情況，為抗結核藥物的合理應用提供實驗依據。

目前我們國家結核病實驗室使用的藥敏方法有直接法和間接法，間接法最常用的方法有絕對濃度法藥敏試驗和比例法藥敏試驗。  

絕對濃度發藥敏試驗時60年代以來結核病實驗室特別是醫院的實驗室用于結核分枝桿菌藥敏試驗的常用方法，其原理是接種同一濃度的菌液在兩支不同濃度的含藥中性改良羅氏培養基上，計數對照培養基和含藥培養基上細菌生長菌落的數量，根據含藥培養基上菌落生長的數量，確定測試菌株對該藥的耐藥性。

比例法藥敏試驗是1996年世界衛生組織在我國開展耐藥監測以來廣泛在結核病實驗室用于耐藥性檢測的方法。其原理是接種兩種不同濃度的菌液在兩支同一濃度的含藥中性改良羅氏培養基上，計數對照培養基和含藥培養基上細菌生長菌落的數量，計算耐藥百分比，確定測試菌株對該藥的耐藥性。

無論是比例法還是絕對濃度法，都需要1個月時間報告藥敏結果。

3.2 液體藥物敏感性試驗

液體藥物敏感性試驗通過對細菌培養代謝產物的檢測，提高了檢測靈敏度，縮短了報告時間。常用的BACTEC系統和MGIT系統，一般在結核病專科醫院應用。

快速培養均利用液體培養基，通過檢測儀器來完成藥敏試驗，但所用儀器價格昂貴，需進口使用廠家的ZL液體培養基，費用較高，且方法仍然建立在以細菌培養的基礎之上，都要通過分枝桿菌的自然生長以積累菌量方能檢出。而分枝桿菌的生長相對緩慢，因而采用上述方法進行藥敏試驗都難以突破“慢”的限制。

3.3 最低抑菌濃度（MIC）測定

通過測定MIC，還可以分析菌株的耐藥程度與耐藥相關基因的突變的關系，為揭示耐藥產生的機制提供信息。

4．分子生物學耐藥檢測方法

4. 1線性探針耐多藥檢測方法（LPA）

運用多重PCR擴增和反向雜交技術，通過檢測RIF和INH耐藥相關基因rpoB、KatG、inhA的突變，可以在1天內診斷結核分枝桿菌對RIF和INH的耐藥性。

4. 2利福平耐藥核酸擴增檢測方法（Xpert MTB/RIF）

Xpert核酸擴增檢測系統將樣品準備、定量PCR擴增和熒光檢測集于一身的核酸檢測分析系統。使用者只需要在獨立的反應孔中加入待檢測的生物樣品，兩個小時內便能快速檢測出患者是否結核以及對利福平是否耐藥。

4. 3 基因芯片耐多藥檢測方法（GeneChip）

基因芯片耐多藥檢測方法是一種可以快速檢測結核分枝桿菌對利福平和異煙肼耐藥性的分子生物學方法，它通過基于對利福平耐藥基因rpoB及異煙肼耐藥基因inhA和katG的擴增，將擴增產物與芯片上預先點制的探針進行雜交，以判斷耐藥基因的常見突變位點的突變情況，此外通過擴增16S rRNA進行菌種鑒定。

5．基因分型方法

5.1 MIRU基因分型方法

MIRU分型法是高等真核生物的基因分型中一種極有價值的研究方法。這種方法基于所謂多態性的微衛星或小衛星區域中重復序列的數量,提供一種簡單、準確的分型手段，是實驗室常用的基因方法之一。

將基因組DNA分離，以每個位點的引物進行PCR擴增（包括H37Rv標準對照和空白對照），擴增產物用凝膠電泳或毛細管電泳分離，根據擴增片斷的大小確定每一位點重復數目。

MIRU結果報告為數字，每個數字對應于按標準順序列出的、不同MIRU位點對應的重復數。在極少的情況下，重復數會大于9。為避免使用兩位數，在報告結果中采用以下表示法：10次重復=“a”；11次重復=“b”；12次重復=“c”；等等。偶爾地，重復數為0。

MIRU 分辨率高，與IS6110-RFL P 分型法結果高度相關。快速、適合于所有結核菌分離株,包括IS6110 拷貝數少的菌株,便于不同實驗室結果比較。

5.2 spoligotyping 基因分型方法

Spoligotyping 是基于結核分枝桿菌基因組中直接重復區(DR)的多態性的分型方法。

基因組DNA分離，PCR方法擴增，包括陽性（H37Rv、BCG）和空白對照，擴增產物與固定在膜上的探針雜交，通過化學發光檢測。

優點是簡單、快速、適合臨床標本，無需培養，結果數字化，便于比較。缺點是分辨率低，尤其對于北京基因型菌株。

6．免疫學診斷技術

免疫學診斷技術是結核病細菌學診斷的重要補充，特別是對菌陰肺結核和肺外結核病患者。

TB-SA抗體檢測法采用結核特異性抗原，TB-SA抗原具有極高的特異性，只存在于結核分枝桿菌和與其緊密相關的同類致病菌中。TB-SA基因的表達，只有在結核桿菌侵入人體巨噬細胞內才發生，排除接種卡介苗的人群對實驗結果的影響，有效控制假陽性。TB-SA抗原蛋白是一種分泌性蛋白，容易被機體識別并引起免疫應答從而產生特異性抗體，在國內應用顯示靈敏度可以達到80%以上。