正確采集臨床微生物檢驗標本，直接影響到病原菌的檢出率。規范的采集、運送、保存與處理臨床微生物檢驗標本，對于保證臨床微生物檢驗工作質量至關重要。可靠的檢驗結果可以指導臨床診斷治療，為臨床科學用藥和控制感染提供依據，是正確、合理使用抗菌藥物，減少細菌耐藥以及醫院感染監測重要的環節。
為準確檢出病原菌，避免漏檢及誤診，臨床醫護人員及實驗室工作人員正確掌握臨床微生物標本采集、運送、保存與處理原則和方法十分重要。為此，溫州醫科大學附屬眼視光醫院/浙江省眼科醫院及中山眼科中心牽頭先后于2014年12月在溫州，2015年4月在廣州組織國內臨床微生物專家、眼科專家、眼科醫院檢驗科及相應實驗室專家，討論并制訂了《感染性眼病細菌學檢查操作專家共識》，為感染性眼病相關微生物學檢查標本采集和處理提供指導。
1 細菌學檢查標本采集基本原則及指征
1.1基本原則
①應在病程早期、急性期、且盡可能在使用抗菌藥物之前采集標本。如果已使用抗菌藥物則根據臨床需要酌情停藥后或下次用藥前采集標本。
②應根據不同的標本類型、檢查目的使用適當的采集、保存、運送工具。對于各種分泌物推薦使用預先用無菌生理鹽水沾濕的符合眼科臨床要求的無菌拭子。采集到的標本應置于無菌容器內送檢。盛裝標本的容器不能使用消毒劑處理，標本中也不得添加防腐劑，以免降低病原菌的分離率。有條件的實驗室應實行床邊接種，無條件的實驗室應將標本保存在運送培養基中送檢。
③應盡可能采集到足量標本并注意無菌操作。采集與外界相通的腔道或體表標本時，如結膜囊分泌物、淚道分泌物等，應注意避免眼瞼、睫毛及周圍皮膚表面正常菌群的污染，以免造成病原菌與正常菌群相混淆致使臨床誤診；采集房水、玻璃體等標本時，應注意嚴格執行無菌操作。
④應由接受過專業培訓的人員進行標本采集。眼表標本包括結膜囊涂片、角膜刮片、睫毛等由經專業培訓過的醫生、護士、實驗室人員采集，眼內標本如房水、玻璃體、異物等由培訓過的手術醫生采集。
⑤標本采集后應立刻送檢（15min內）。由于大多數眼部標本的取材量少，建議進行床邊接種和制備涂片。
⑥采集標本前，充分與病人溝通，取得病人的理解和配合。
1.2采樣指征
①懷疑急性細菌性結膜炎、角膜炎、眼內炎、眼瞼/眶蜂窩組織炎、瞼緣炎、瞼皮炎、淚腺及淚道感染疾病等。
②懷疑眼部慢性細菌性感染，但常規抗菌藥物治療無效時。
③眼外傷后懷疑細菌感染時。
④內眼手術前結膜囊細菌培養。
⑤角膜移植組織、角膜保存液、隱形眼鏡及其他眼科材料、眼藥等需要排除細菌污染時。
2 常見標本類型采集方法及采集量
2.1結膜囊分泌物的采集
2.1.1采集器具 推薦使用植絨拭子[1]、無菌生理鹽水或其他符合眼科使用要求的培養基，如大豆-酪蛋白湯（TSB）等。
2.1.2采集方法
標本應由經過培訓的專業人員采集；采樣前使用無菌生理鹽水/TSB等預先濕潤拭子（注意盡量在試管壁上擠壓去掉多余液體）；采樣時盡量不用麻醉劑，囑患者向上注視，翻轉下眼瞼，暴露下方球結膜和下穹隆結膜，用無菌生理鹽水/TSB等濕潤過的無菌拭子由內眥部開始從內到外旋轉輕拭下方結膜囊和下瞼結膜表面（注意不遺漏內眥部），避免接觸睫毛和瞼緣，必要時使用開瞼器等器具物品，采樣后立即送檢，或將標本放入無菌轉運管中做好標記立即送往微生物學實驗室[2-3]。
2.2淚道標本的采集
標本采集應由經過培訓的專業人員操作；采集淚道標本時，將一拭子放置在淚小管區后方，壓迫淚囊或淚小管皮膚面，用另一預先濕潤過的拭子擦取淚小點處反流物。
2.3結膜/角膜刮片的采集
2.3.1采集器具
推薦使用無菌15號手術圓刀片[4]。
2.3.2結膜刮片采集
刮取前，先滴表面麻醉藥滴眼液[4]（盡可能使用無防腐劑的制劑），對結膜進行表面麻醉；若結膜病變處分泌物過多，可先用滅菌濕棉簽去除分泌物；翻轉眼瞼暴露瞼結膜；一手固定瞼結膜，另一手持滅菌刀片，使刮刀與組織表面垂直；根據病變情況和檢查需要，選擇刮取部位并刮取標本；刮取標本后，滴用抗菌藥物滴眼液。
2.3.3角膜刮片采集
刮取前，先滴表面麻醉藥滴眼液[4]（盡可能使用無防腐劑的制劑），對結膜進行表面麻醉；用手指將瞼裂開大，或用開瞼器撐開眼瞼，若病變處分泌物過多，可先用滅菌濕棉簽去除分泌物；囑咐病人避免眼球轉動；選角膜潰瘍的進行緣或基底部刮取標本；刮取標本后，滴用抗菌藥物滴眼液。
2.4房水采集
由培訓過的眼科醫生在手術室內完成；麻醉并進行常規結膜囊清潔后，用1ml無菌注射器，于角鞏膜緣平行虹膜平面穿刺入前房，避開膿性液抽取房水約0.1ml。
2.5玻璃體采集
2.5.1注射器抽取法
由培訓過的眼科醫生在手術室內完成；麻醉并進行常規結膜囊清潔后，以22號一次性針頭連接1ml無菌注射器，角鞏膜緣后平坦部垂直鞏膜向眼球中心方向穿刺入玻璃體腔10mm，抽取盡可能多的玻璃體樣品（不少于0.2ml）。
2.5.2玻璃體切割頭法[5]
由培訓過的眼科醫生在手術室內完成；麻醉并進行常規結膜囊清潔后，玻璃體切割頭吸引管接口外接1ml 無菌注射器，并手動抽吸；標準三通道切口，在向眼內灌注眼內擾動前，將已在吸引管接口外接無菌注射器的玻璃體切割頭置于玻璃體腔中心區，抽取玻璃體樣本不少于0.5ml（含灌注液的大體積標本需特殊處理，申請單需注明用藥情況，采集最初的灌注液，不少于1.0ml）。
2.6異物采集
由培訓過的眼科醫生在手術室內完成，注意無菌操作。
3 常見標本類型的預處理措施
3.1結膜囊分泌物
標本采集完成后，直接用無菌拭子（已有無菌生理鹽水或TSB濕潤過）在血瓊脂平板、普通巧克力瓊脂平板（需5%~10%的CO2環境）、厭氧血瓊脂平板[6]（必要時）表面以棉簽滾動的方式涂布接種后，取潔凈的玻片，將另一棉簽標本制成涂片送形態學檢查；若由于實際需要需將拭子接種于增菌培養基，則報告時需注明。
3.2淚道標本
淚道分泌物基礎培養基接種及制作涂片方法同結膜囊分泌物。
淚道結石，推薦使用研磨器研磨后，一份用壓片的方式進行形態學檢查，一份以折線路徑涂布接種于普通巧克力瓊脂平板（需5%~10%的CO2環境），有條件的實驗室增加接種巰基乙酸鹽肉湯進行厭氧培養[7]。
3.3結膜及角膜刮片
用刀片采集盡可能多的標本后即時接種，或將刮取物置于轉運試管（帶轉運拭子和運送培養基），并確保標本浸入液體轉運介質中[4]。
經研磨或充分震蕩后，實驗室人員將標本接種于血瓊脂平板、普通巧克力瓊脂平板以及制作涂片做形態學檢查（最好是標本直接涂片），必要時增加厭氧培養。
3.4房水及玻璃體液
常規方法：手術采集房水（0.1~0.2ml）/玻璃體液（0.5ml），量盡可能多，分別用注射器加0.05/0.2 ml標本至液體增菌培養基（專用培養基或兒童血培養瓶）[5，8],0.05/0.2ml標本至真菌培養基內（標本量足夠時建議增加厭氧培養），剩余標本直接滴于潔凈玻片上，制成涂片，盡快送至實驗室。
3.5 異物
異物取出后，放入1ml液體增菌培養液充分振搖1min，異物交還臨床，培養液分別接種血瓊脂平板、普通巧克力瓊脂平板以及制作涂片做形態學檢查。
3.6刮片及分泌物涂片制作要求
標本采集完成后，用無菌拭子或拔除針頭后的注射器在潔凈帶磨砂玻片中間位置，自內而外涂成直徑1.0~1.5cm的近圓形，制成兩張涂片，做好標記，待涂片自然干燥后推薦用95%乙醇固定5min或滴加10%甲醇直接固定[5，9]。
4 標本運送
標本采集后盡快送至實驗室。特殊情況下，標本無法送達實驗室時，應使用運送培養基，置于室溫保存，不可冷藏或冷凍，且不應超過12 h。運送過程需符合生物安全要求。
5 標本常規檢查項目及報告方式
5.1染色方法的選擇
實驗室接到標本后，根據不同需要選擇不同的染色方法，常規推薦革蘭染色和瑞氏吉姆薩染色，必要時增加抗酸染色等（可在前兩種染色基礎上直接進行抗酸染色），也可根據臨床醫師的建議選擇其他特殊染色方法。
5.2涂片及刮片鏡檢報告格式
5.2.1病原學報告：細菌：找到革蘭陽/陰性球/桿菌，要描述排列方式，細菌與白細胞及吞噬細胞的關系，如吞噬等；真菌：要描述菌絲及孢子形態，詳見真菌檢驗規范；觀察全部涂片區未找到細菌，則報告未找到。
5.2.2細胞學報告 根據瑞氏吉姆薩染色結果，報告視野中白細胞/上皮細胞/單核細胞/巨噬細胞等種類，數量可按照“某一類細胞數/HP”，特殊情況下白細胞可以按照中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞等分別報告。
5.2.3報告形式：常規使用文字描述報告；有條件的單位，建議發圖文報告，圖片采用油鏡（×1000）下形態，1h內報告。
5.3細菌培養實驗室內的操作及要求
5.3.1標本采集后應盡快接種于血瓊脂平板和普通巧克力瓊脂平板并及時送到微生物實驗室。實驗室收到標本后，血瓊脂平板置普通孵箱35~37℃培養，普通巧克力瓊脂平板置5%~10%CO2孵箱培養48h（結果陰性但臨床高度懷疑感染的標本需要再繼續培養24h[2]，最長不超過5天[3，6]），至少24h觀察1次，必要時12h觀察1次，如果有菌落生長則結合標本涂片結果進行分析后，進一步完成細菌鑒定和藥敏試驗。厭氧菌培養按厭氧菌培養規范處理。
5.3.2接種于增菌液（手工法建議用雙相瓶，儀器法用兒童瓶）的標本，置于35~37℃恒溫培養箱培養，每天觀察（至少3次）或直接作為血培養標本上全自動血培養系統，一旦發現陽性，立即無菌抽取瓶中培養液轉種血瓊脂平板和普通巧克力瓊脂平板[3，6]，血瓊脂平板置普通孵箱35~37℃培養，普通巧克力瓊脂平板置5%~10%CO2環境孵箱中培養，同時做涂片，結合標本涂片結果進行分析后，第一時間將涂片結果作為一級報告發送。然后后續的生長情況、生化鑒定反應及藥敏結果等給予完整報告。如果手工法培養7天后,儀器法培養5天后未見生長，則報告陰性結果，建議陰性報告當天取培養物直接涂片行革蘭染色并盲傳血平板和巧克力平板，如盲傳陽性則補發報告單，并和臨床做好溝通。
5.3.3厭氧菌培養標本接種厭氧平板置厭氧環境中35~37℃培養至少48 h[10]，無菌生長5 d[11] ，必要時可延長至7 d[12] 報告，具體根據厭氧菌操作規程進行。
6病原診斷報告
6.1分泌物、結石、角膜刮片等標本
6.1.1陽性結果 有 #種菌生長， ##細菌（注明鑒定方法，如手工、儀器，及鑒定結果的分值，并保存原始記錄），結合標本涂片結果進行分析后報告可疑的致病菌并給出建議，同時報告藥敏結果。
6.1.2陰性結果：培養48 h（自接種到固體培養基開始計時），未見致病菌生長。
6.2房水、玻璃體、異物等標本
6.2.1陽性結果 有 #種菌生長， ##細菌，結合標本涂片結果進行分析后報告可疑的致病菌，同時報告藥敏結果。
6.2.2陰性結果 直接培養48h（自接種到固體培養基開始計時），增菌培養手工法7 d，儀器法5d，報無細菌生長。如果涂片找到細菌，培養未見細菌生長，應備注提示。
6.3懷疑分枝桿菌感染的標本建議按照分枝桿菌的常規方法處理。
6.4危急值報告，包括房水、玻璃體、異物及其他眼內容物等培養陽性結果，按危急值報告程序處理。
6.5拒收標本標準 采集量過少；標本明顯污染；申請單填寫不全等。如有特殊情況，臨床要求出結果的，則需添加備注“已通知臨床，結果僅供參考”。
7 生物安全
所有標本均應視為具有潛在生物危害的標本，必須按照標準防護措施處理標本。
另附說明：
1.本規范暫以試用版發布，并在臨床試用1年后集中反饋意見，并根據實際情況修改后再正式發布。
2. 本規范僅供醫務人員在臨床工作中參考，不具備法律功效，其中觀點及操作要點也需要隨著各種技術的進步不斷完善。