PCR常見問題及解決方案

PCR常見問題及解決方案

　　1沒有擴展條帶

　　可能的原因及對應的解決方案如下：

　　酶失活或在反應體系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果。

　　模板含有雜質。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結果。

　　變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環就迅速失活；過低則模板變性不徹底。

　　反應系統中污染了蛋白酶及核酸酶，應在未加Taq酶以前，將反應體系95℃加熱5~10分鐘。

　　引物變質失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲存條件不當而失活。

　　引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。

　　DNA凝膠電泳時加入陽性對照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。

　　2PCR產物量過少

　　可能的原因和對應的解決方案如下：

　　退火溫度不合適。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。

　　DNA模板量太少。增加DNA模板量。

PCR循環數不足。增加反應循環數。

　　引物量不足。增加體系中引物含量。

　　延伸時間太短。以1kb/分鐘的原則設置延伸時間。

　　變性時間過長。變性時間過長會導致DNA聚合酶失活。

　　DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈

　　3擴增產物跑電泳條帶彌散

　　可能的原因和對應的解決方案如下：

　　酶量過高。減少酶量；酶的質量差，調換另一來源的酶。

　　dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。

　　MgCl?濃度過高。可適當降低其用量。

　　模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。

　　引物濃度不夠優化。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應。

　　循環次數過多；增加模板量減少循環次數至30，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環。

　　退火溫度過低。

　　電泳體系有問題：

　　①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；

　　②凝膠沒有凝固好；

　　③瓊脂糖質量差。

　　若為PCR試劑盒則可能：

　　①由于運輸儲存不當引起試劑盒失效；

②試劑盒本身質量有問題，如引物選擇、循環參數等選擇不當。

　　降解的陳舊模板擴增也易產生涂布。

　　4擴展產物出現雜帶

　　可能的原因和對應的解決方案如下：

　　引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。

　　循環的次數過多。適當增加模板的量，減少循環次數。

　　酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。

　　退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。

　　樣品處理不當。

　　Mg2+濃度偏高，因適當調整Mg2+使用濃度。

　　若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。

　　復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。

　　反應緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。

　　引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。

　　引物量過多。減少反應體系中引物的用量。

　　模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。

外源DNA污染。確保操作的潔凈。

　　5條帶大小與理論不符

　　可能的原因和對應的解決方案如下：

　　污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行清潔。

　　模板或引物使用錯誤。更換引物和模板。

　　基因亞型。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。

　　6陰性對照出現條帶

可能的原因和對應的解決方案如下：

試劑，槍頭，工作臺污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行清潔。