基因芯片技術在瘧疾研究中的應用

隨著人類基因組( human genome p roject, HGP) 、多種模式生物(model organism)和部分病原體基因組測序的完成,基因序列數據以前所未有的速度不斷增長。傳統實驗方法已無法系統地獲得和詮釋日益龐大的基因序列信息,研究者們迫切需要一種新的手段,以便大規模、高通量地研究眾多基因在各種生理、病理狀態下的多態性及其表達變化,從而揭示它們的功能、相互作用和調控關系。在此背景下, 20世紀80年代末基因芯片( gene chip)技術應運而生,它利用微電子、微機械、生物化學、分子生物學、新型材料、計算機和統計學等多學科的先進技術,實現了在生命科學研究中樣品處理、檢測和分析過程的連續化、集成化和微型化。近年,基因芯片技術在疾病易感基因發現、疾病分子水平診斷、基因功能確認、多靶位同步超高通量藥物篩選以及病原體檢測等醫學與生物學領域得到廣泛應用 。

    瘧疾是一種經按蚊傳播、由瘧原蟲感染所致的寄生蟲病,在世界范圍內流行形勢嚴峻, 2005年全球有100多萬人死于該病 。目前,瘧疾診斷、治療及疫苗等領域研究已深入到分子水平。2002 年惡性瘧原蟲和岡比亞按蚊基因組草圖繪制完成,隨之瘧疾研究的重心開始轉向功能基因組學研究,基因芯片技術在新形勢下的瘧疾研究中發揮著越來越重要的作用。現就基因芯片基本原理及其在瘧疾研究中的應用綜述如下。

1 基因芯片技術的基本原理
    基因芯片又稱DNA芯片(DNA chip )或DNA微陣列(DNA microarray)。其原理是采用光導原位合成或顯微印刷等方法將大量特定序列的探針分子密集、有序地固定于經過相應處理的硅片、玻片、硝酸纖維素膜等載體上,然后加入標記的待測樣品,進行多元雜交,通過雜交信號的強弱及分布,來分析目的分子的有無、數量及序列,從而獲得受檢樣品的遺傳信息 。其工作原理與經典的核酸分子雜交如Southern和Northern印跡雜交一致,都是應用已知核酸序列與互補的靶序列雜交,根據雜交信號進行定性與定量分析。經典雜交方法固定的是靶序列,而基因芯片技術固定的是已知探針,因此基因芯片可被理解為一種反向雜交。基因芯片能夠同時平行分析數萬個基因,進行高通量篩選與檢測分析,解決了傳統核酸印跡雜交技術操作復雜、自動化程度低、檢測目的分子數量少等不足。根據所用探針類型,基因芯片可分為cDNA ( comp lement DNA)芯片和寡核苷酸芯片;根據檢測目的又可分為表達譜芯片和單核苷酸多態性( single nucleotide polymorphisms, SNP)芯片。隨著芯片技術在其他生命科學領域的延伸,基因芯片概念已泛化到生物芯片,包括基因芯片、蛋白質芯片、糖芯片、細胞芯片、流式芯片、組織芯片和芯片實驗室( laboratory on a chip)等。

    芯片基片可用材料有玻片、硅片、瓷片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜和尼龍膜,其中以玻片最為常用。為保證探針穩定固定于載體表面,需要對載體表面進行多聚賴氨酸修飾、醛基修飾、氨基修飾、巰基修飾、瓊脂糖包被或丙烯酰胺硅烷化,使載體形成具有生物特異性的親和表面。最后將制備好的探針固定到活化基片上,目前有兩種方法:原位合成和合成后微點樣 。根據芯片所使用的標記物不同,相應信號檢測方法有放射性核素法、生物素法和熒光染料法,在以玻片為載體的芯片上目前普遍采用熒光法。相應熒光檢測裝置有激光共聚焦顯微鏡、電荷偶合器( charge coup led devices, CCD)、激光掃描熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描儀等。其中的激光共聚焦掃描儀已發展為基因芯片的配套檢測系統 。經過芯片掃描提取雜交信號之后,在數據分析之前,首先要扣除背景信號,進行數據檢查、標化和校正,消除不同實驗系統的誤差。對于簡單的檢測或科學實驗,因所需分析基因數量少,故直接觀察即可得出結論。若涉及大量基因尤其是進行表達譜分析時,就需要借助專門的分析軟件,運用統計學和生物信息學知識進行深入、系統的分析,如主成分分析、分層聚類分析、判別分析和調控網絡分析等 。芯片數據分析結束并不表示芯片實驗的完成,由于基因芯片獲取的信息量大,要對呈數量級增長的實驗數據進行有效管理,需要建立起通行的數據儲存和交流平臺,將各實驗室獲得的實驗結果集中起來形成共享的基因芯片數據庫,以便于數據的交流及結果的評估。

2 基因芯片技術在瘧疾研究中的應用
2. 1  基因芯片技術在瘧原蟲研究中的應用
    基因芯片技術的出現有力地促進了人們對瘧原蟲生物學的認識。早在2000年,惡性瘧原蟲的基因組測序尚未完成, Hayward等根據惡性瘧原蟲綠豆核酸酶基因文庫, 制成“鳥槍”DNA ( shotgun DNA)芯片,分析了瘧原蟲滋養體和配子體之間的基因表達差異,為瘧原蟲發育阻斷劑和疫苗研究提供了有益線索。惡性瘧原蟲全基因組測序完成后,瘧原蟲高通量表達譜芯片的應用得到進一步推廣。為闡明瘧原蟲發育的分子調節機制,多位研究者以cDNA或寡核苷酸為探針制成芯片,比較分析瘧原蟲不同發育周期的基因表達變化。如Le Roch等比較了惡性瘧原蟲紅細胞內各發育階段2號染色體上轉錄組的差異。Ben Mamoun 和Isokpehi 等研究了惡性瘧原蟲紅細胞內各發育階段的基因表達變化。Bozdech等分析了惡性瘧原蟲裂殖子與滋養體表達譜的差異。Young等則觀察了惡性瘧原蟲配子體Ⅰ～Ⅳ期轉錄組的變化。此外,Vontas等還利用芯片技術分析了伯氏瘧原蟲動合子及其早期卵囊體外培養的基因表達差異。
    基因芯片技術也可用于比較不同種或同種不同株瘧原蟲的基因表達差異, Ganesan等利用芯片研究了惡性瘧原蟲Dd2 和HB3 株基因表達差異。Hall等比較了伯氏、夏氏、約氏和惡性瘧原蟲的基因表達差異。Gissot等利用芯片技術分析了紅內期不同時點惡性瘧原蟲3D7株及F12株之間表達譜的差異,并發現了影響配子體生成的候選基因。近年,基因芯片在瘧原蟲研究中的應用范圍進一步拓寬,研究內容涵蓋瘧原蟲新基因發現 、疫苗靶標篩選 、轉錄因子調控網絡、瘧原蟲適應人體宿主機制、瘧原蟲比較基因組雜交分析 、惡性瘧原蟲抗原變異分子機制以及瘧原蟲攻擊紅細胞機制等。總之基因芯片技術正逐步成為瘧原蟲分子生物學研究的有力工具。
2. 2　基因芯片技術在傳瘧按蚊研究中的應用
    基因芯片在按蚊研究中最先用于探討按蚊對原蟲的抗性機制,在2003年, Kumar等利用基因芯片比較了對瘧原蟲易感和抗性的岡比亞按蚊基因表達的差異,發現岡比亞按蚊對瘧原蟲的抗性與活性氧( reactive oxygen species, ROS)的產生和代謝關系密切。
    按蚊對殺蟲劑的抗性問題日益突出,給瘧疾的預防和控制帶來困難,芯片技術的出現為人們認識按蚊殺蟲劑抗性的產生機制提供了新手段。2005年David和Vontas等設計出岡比亞按蚊基因芯片,比較了殺蟲劑敏感按蚊與抗性按蚊中230個殺蟲劑代謝相關基因的表達情況,結果發現谷胱甘肽S轉移酶( glutathione-S-transferase, GST) 、細胞色素314A1 (CYP314A1) 、細胞色素P450 s等基因與滴滴涕( dichloro-diphenyl-trichloroethane, DDT)抗性有關,擬除蟲菊酯抗性按蚊的P450、CYP325A3基因表達上調。2005年Dana和Marinotti 等分別借助cDNA和表達序列標簽( exp ressed sequence tag,EST)芯片,觀察血餐前后不同時間點岡比亞按蚊基因表達的變化,探討了按蚊對血細胞的消化、免疫反應以及卵的形成和運動的分子機制。2006 年Dissanayake和Strode等利用基因芯片技術比較了岡比亞按蚊不同發育階段和不同組織的基因表達譜差異,發現約1 /4基因的表達受發育調節。
    此外,另有研究者分別利用基因芯片研究了按蚊與原蟲之間的相互作用機制 、按蚊基因調控網絡 、按蚊唾液腺轉錄本 、按蚊對原蟲的免疫應答等。總之,基因芯片技術的應用已顯著拓寬和提高了傳瘧按蚊的研究領域和研究水平。
2. 3　基因芯片技術在瘧疾動物模型研究中的應用
    動物模型在人類瘧疾的病理學研究、疫苗開發和治療試驗等方面發揮著不可替代的作用,基因芯片技術與動物模型的結合,更進一步加深了人類在分子水平上對瘧疾的認識。2004年Sexton等利用基因芯片分析了鼠瘧原蟲轉錄組的變化,結果發現鼠感染原蟲后腦部400余基因及脾臟600余基因的轉錄發生了變化,這些變化反映了鼠紅細胞生成抑制、糖酵解和干擾素介導的免疫應答增強,從而找到瘧疾導致中樞神經系統癥狀、貧血和乳酸增多癥的可能機制。2005年Sarfo等利用cDNA芯片分析了趨化因子及其受體在約氏瘧原蟲感染小鼠腦部的表達情況,結果發現趨化因子RANTES ( regulated on activation, normal T cell exp ressed and secreted)及其相應受體CCR1、CCR3和CCR5的mRNA在感染小鼠的腦部表達上調,參與了小鼠小腦的炎癥介導、細胞降解和超微結構改變。2006年Delahaye等利用cDNA芯片比較了腦型瘧易感型與抵抗型小鼠腦部的基因表達差異,分析確定了可能與小鼠腦型瘧易感性有關的31個候選基因。
    為探討病原體間的免疫協同作用, 2005年Page等利用芯片分析了結核分支桿菌與約氏瘧原蟲混合感染及單獨感染時小鼠脾臟細胞的Ⅰ型免疫應答情況,發現混合感染組小鼠脾臟細胞γ干擾素( interferon gamma, IFN2γ)和腫瘤壞死因子α ( tumor necrosis factor alpha, TNF2α)的生成水平顯著高于單獨感染組。結論認為結核分支桿菌可以增強Ⅰ型免疫應答來保護小鼠免受致死性鼠瘧損傷。2006 年有研究者利用cDNA芯片分析了惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白Ⅰα(CDCRⅠα)的活化對人類基因表達的影響,結果提示CDCRⅠα可以激活多條免疫途徑,促進B 細胞多克隆活化和凋亡延遲。從而找出了瘧疾流行區Burkitt ’s 淋巴瘤危險性增加的潛在原因。

3 問題與展望
    目前,基因芯片技術在瘧疾相關研究中的應用尚處于起步階段,但已顯示出巨大的潛力和良好的前景,然而在實踐中還存在一些困難和問題,主要有: (1)研究成本較高,由于芯片制作和檢測需專門的儀器設備,一般實驗室難以承擔其高昂的費用,無法獨立開展研究; ( 2)方法標準化不足,由于各實驗室設備和處理方法等因素的不同,眾多數據間常不具備可比性,不利于芯片數據共享; (3)配套軟件不夠完善,現有基因芯片檢測軟件和生物信息學分析軟件尚不能充分滿足芯片檢測結果的讀取、分析、挖掘和解釋; (4)研究領域有待拓寬,以往瘧疾基因芯片研究主要集中在表達譜分析上, SNP相關研究較少,而SNP芯片技術已日趨成熟,并在眾多生命科學領域取得成功,因此有必要重視和推進SNP芯片在瘧疾研究中的應用; ( 5)基因序列信息有限, 基因芯片研究需要大量已知準確的DNA、cDNA或EST序列信息,但目前間日瘧原蟲和多種按蚊的全基因組測序工作尚未完成。
    雖然基因芯片技術還存在諸多問題,但其在瘧原蟲、傳瘧按蚊和瘧疾動物模型等研究領域中已顯示出特有優勢。隨著微電子、微機械等技術上的突破以及生物化學、分子生物學和生物統計學等學科的發展,基因芯片在瘧疾研究中必將具有更為廣闊的發展空間。近年,瘧原蟲對抗瘧藥的抗性形勢日趨嚴峻,現場和實驗室研究發現多個基因可作為瘧原蟲抗性分子標志,但傳統檢測方法耗時、耗力,限制了抗性分子標志在現場中的應用;而芯片技術具有高速度、高通量的優勢,因此構建基于寡核苷酸探針的抗性基因檢測芯片顯得十分必要。此外,基因芯片技術還有待應用于抗瘧藥的篩選、瘧疾快速診斷、疫苗靶標尋找、瘧原蟲致病機制研究、蟲株分型鑒定、按蚊對殺蟲劑抗性機制探討等領域。基因芯片技術與其他技術的聯合應用,還將有助于從基因、轉錄、表型多水平理解瘧疾的傳播和發病機制。甚至,最終可以通過芯片技術實現瘧疾基因水平研究全過程的集成化和自動化,即瘧疾芯片實驗室 。不難預見,基因芯片技術的不斷完善和發展,將使其在瘧疾研究中得到更為廣泛的應用,并有力促進瘧疾診斷、治療和預防控制水平的提高。