細胞培養基本方法

一)準備和安裝過濾器  
清洗好過濾器，干燥，放入一張孔徑0.22μm的微孔濾膜，用布包裝好，15磅20 min進行高壓滅菌處理。 在超凈臺內打開過濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。用泵過濾，過濾后要檢查濾膜是否完好無損。 

(二)合成培養基的配制 
1、根據細胞目錄中的說明，按下表選擇合適品牌及貨號的培養基干粉，用適量超純水充分溶解。

2、 按要求添加碳酸氫鈉、谷氨酸鈉、HEPES等，充分攪拌使之溶解。 
3、 調 pH至7.2左右。 
4、 加水至終體積。 
5、 在超凈臺中對溶液進行濾過除菌，分裝入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞緊瓶口。 
6、 瓶口封好，4℃冰箱貯存。

  (三)小牛血清的處理 
市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補體(近來也有觀點認為熱滅活處理是不必要的)。胎牛血清不必滅活。 
1、 將血清加熱至56℃并保持30 min，其間要不時輕輕晃動，使受熱均勻，防止沉淀析出。 
2、 處理后的血清貯存于4℃。 
3、 小牛血清在使用前好進行篩選以掌握血清的質量。 

(四)生長培養基的配制 
除無血清培養之外，各種合成培養基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。 
1、培養基分裝成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。 
2、按如下比例配制： 基本培養基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。 按1％體積分數加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U／mL和100 μ／mL，。 

(五)凍存細胞的復蘇 
1、應遵守慢凍快融的原則。先將水浴鍋調至37-37。5度，取出凍存的細胞迅速放入后將細胞面浸至水面以下不斷搖動至融化。 
2、將解凍后的細胞液在常溫條件下，1000rpm離心5分鐘。 
3、棄上清，用少量培養基將細胞懸起，將細胞懸液轉移至事先加入5ml完全培養基的T-25培養瓶中。將細胞混勻后，置培養箱中培養。

 (六)傳代: 
1、貼壁細胞: 
對于貼壁細胞應先吸(倒)盡培養基，吸的越干凈越好，以免中和后加入的消化液，使強度減弱（或PBS洗1－3次）。50ml培養瓶加入消化液約1-3ml，按此比例進行消化，(根據經驗)，晃動使消化液鋪均勻置37度培養箱約2-5分鐘，鏡下見細胞收縮變圓或少數脫落后，輕輕振動瓶底使細胞全部脫落，加入2-3ml完全培養基后，輕輕吹打，使細胞基本成單個懸浮，然后分置其它無菌培養瓶內，加入完全培養基后繼續培養或實驗。 
2、懸浮細胞: 
一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養瓶內，加入完全培養基繼續培養，如要高濃度可先離心1000rpm，5min后加入完全培養基，輕輕吹勻后，分置其它培養瓶內加入完全培養基繼續培養。 

(七)凍存 
將貼壁細胞消化后離心收集，懸浮細胞直接離心收集，以完全培養基或胎牛血清重懸細胞至終濃度約106/ml。加入10%的DMSO。以每管1～2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過夜。次日保存到液氮中。 

(八)注意事項 
1、玻璃吸管和玻璃培養瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140度2小時以上; 
2、無菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上;各種培養板照射3小時以上; 
3、培養基(pH7.2)和血清配制好后要做無菌試驗:將血清按10%加入培養基內，用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取完全培養基5-10ml置培養箱內培養2-3天，肉眼見無渾濁或沉淀等異物。分裝后置4度保存; 
4、消化液(pH7.8)或其它加入液，應用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌，分裝成支置-20度保存; 
5、培養箱應先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外線的應照射1小時以上，如有高溫滅菌的應按程序來菌)。至少每月一次。 
6、進入操作時應注意先清洗雙手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作時注意無菌臺內空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往，如果數量較多，培養瓶應放在與酒精燈平行地方便于操作，瓶與瓶之間應相隔一定的距離，開瓶(蓋)時應先用75%酒精反復擦拭或用燈燒，打開后應用燈先燒口，然后燒蓋。用完后同樣操作。整個操作過程盡量在無菌臺靠里面一點。

干細胞培養基本方法

MEF P0細胞培養Protocol

復蘇：

1. 將MEF P0細胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。

2. 將凍存管內細胞懸液轉移至含3-4 ml MEF完全培養液的15 ml離心管內，以1000 rpm，離心5 min。

3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的MEF完全培養液2 ml，吹打懸浮。

4. 輕輕吹打，制成單細胞懸液，盡量避免氣泡。

5. 按照MEF細胞說明書上建議的復蘇培養體系轉移至1個T75培養瓶中培養，加入培養液14 ml。

6. 放入37℃培養箱內培養。

7. 復蘇第二天觀察，如死細胞較多，更換新鮮的MEF完全培養液，可以使細胞生長的更好。

傳代：

1. 待細胞長到90%-100%滿時進行傳代，一般3-4天，具體視細胞生長情況而定。

2. 吸除廢液。

3. 用PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。

4. 加入2.5 ml的0.25%胰酶（含EDTA）至培養瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面，置于37℃培養箱內消化細胞。

5. 在顯微鏡下觀察，直至細胞層全部脫落（一般需要1-2 min）。

6. 加2.5 ml MEF完全培養液終止消化。

7. 多次輕輕吹打細胞，制成單細胞懸液。

8. 按照1:2-1:3的比例進行傳代。

9. 放入37℃培養箱內培養。

凍存：

1. 按傳代的方法將細胞消化下來，制成細胞懸液。

2. 以1000 rpm，離心5 min，棄上清，逐滴加入已經預冷的凍存液，懸浮細胞。

3. 按每支凍存管內加入500 ml細胞懸液分裝到凍存管內，標記細胞名稱、代數、凍存日期等基本信息。

4. 將凍存管置于程序降溫盒內，-80℃過夜，轉入液氮。

凍存液配方： 
MEF完全培養液80%，FBS10%，DMSO 10%

si lie霉素c處理：

1. 一般地，P0代MEF細胞傳至P3代時，可以進行絲裂 ，霉素C（Sigma，M0503）處理。處理過后的MEF細胞不再增殖，可直接作為feeder使用。

2. 傳至P3代的MEF細胞長至80%以上時，吸出舊的MEF完全培養液，加入含絲裂，霉素C（終濃度10 mg/ml ）的新鮮MEF完全培養液（以T75培養瓶為例，加入培養液的體積為10ml ）。37℃培養箱溫育處理3小時。

3. 吸出培養液，用PBS快速洗4遍以去除殘余的絲裂 ，霉素C。

4. 消化細胞、細胞計數并凍存。一般地，一個T25培養瓶鋪1′106細胞。