光譜流式與質譜流式之“爭”

質譜流式技術是近來年發明的一門新興技術，它利用金屬同位素標簽替代熒光標簽，并利用質譜對標簽進行定量，通過結合質譜和流式細胞技術，可以同時對單細胞進行超多參數、無需補償的測量，大大增強了評估復雜細胞系統和過程的能力，彌補了熒光流式的不足。其高通量、高靈敏度和高穩定性的特點尤其適合于免疫、腫瘤、血液、藥物和遺傳學等學科的研究中。

流式細胞技術在生物研究中有非常廣泛的應用，然而隨著科學工作者對研究精確度越來越高的要求，以及大數據所能產生的結果準確度的追求，引領了一門新興技術的崛起，即質譜流式技術的創新。與傳統流式技術比較，質譜流式很好地覆蓋了原來技術的不足，給許多研究帶來了極大的便利。在生物研究方面便是如此，其高通量、高靈敏性和高穩定性的特點與許多領域研究要求十分匹配，尤其在免疫、腫瘤、血液等高度細胞異質性的學科或是藥物、遺傳學等高通量的學科以及細胞分子生物學、生物化學等基礎學科的研究中。

一）質譜流式細胞技術發展歷史

2009年，多倫多大學的Scott Tanner及其同事將電感耦合等離子體（inductively coupled plasma，ICP）的質譜方法應用于測量細胞內外事件，開發出質譜流式細胞儀（cytometry time of flight，CyTOF）［1, 2］以及相關試劑，由DVS Sciences公司生產和分銷。2012年，Nolan一篇應用質譜流式測量細胞周期的文章引起了人們對該技術的關注，被譽為是“流式細胞技術的一次革命”。2014年，美國Fluidigm公司收購DVS Science公司以及CyTOF技術，后來又推出條形碼試劑盒、金屬標記試劑盒和預聯抗體等商業化應用以簡化流程、減少數據采集時間、提高數據質量［3］。2014年，中國首臺CyTOF2質譜流式細胞儀正式引入于廈門大學細胞應激生物學國家重點實驗室。

（二）質譜流式細胞技術工作原理

質譜流式與傳統熒光流式細胞技術工作流程基本相同，只在兩方面有所改動：一是由金屬標簽替代熒光標簽，二是采用元素-電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）來定量同位素標簽。用金屬同位素標記靶特異性抗體，然后與相應細胞結合；到目前為止，質譜流式研究的標記元素和同位素包括釔（Y）、銦（In）、鑭系元素（Ln，從La到Lu，Pm除外）、碘（I）、鎘（Cd）、碲（Te）、銀（Ag）、鈀（Pd）、銠（Rh）、銥（Ir）、鉑（Pt） ［4］。ICP-MS主要由氬等離子體、四極管和飛行時間探測器（time-of-flight，TOF）組成；氬等離子體可以使樣品汽化、打破所有分子鍵，并從每個原子中剝離一個電子，產生帶電荷的自由原子；四極管則用來選擇相對分子質量范圍為80~200的離子，使金屬保持一定的電荷和質量范圍，過濾掉不需要的離子；在TOF中，所有離子通過已知強度的電場加速，并且測量這些離子在已知距離上到達檢測器所花費的時間，而該“飛行時間”與離子質量有關［2，5］。

總工作流程是：先用稀有重金屬同位素通過螯合蛋白共價連接到抗體或其他探針上；在標記抗體后，細胞以單細胞懸浮液的形式被引入霧化器；細胞通過氬等離子體產生離子云，在TOF中按質荷比分開；最后將原子質量譜的數據轉換為細胞表面或內部的信號分子數據，并通過專業分析軟件對獲得的數據進行分析，從而實現對細胞表型和信號網絡的精細觀察［3，6］。

（三）與傳統流式技術的對比

質譜流式最大的特點是使用金屬標簽。其優勢在于：（1）金屬標簽的多樣性在理論上確保可以對單細胞進行上百個參數的檢測；（2）稀有重金屬元素在細胞內很少出現，因而減低了背景信號；（3）由于ICP對元素高超的分辨能力，不需要進行補償或矯正；（4）質譜流式細胞儀中測得不同元素之間靈敏度相當；（5）這種方法使得在單細胞水平上測量新的金屬參數，包括鉑（一種抗癌藥物）、鋇（一種MRI成像對比劑）、碘（放射性碘療法）和金（用于實驗性自身免疫療法）。其他優點還包括多參數數據可以在單細胞水平進行深層分析以及多樣性分析；穩定性高，不同時間對同一標本檢測結果變異系數≤3%。

然而，金屬標簽也帶來了許多問題：（1）金屬標簽做成的商品化探針為螯合聚合物，它最多允許100個左右的離子附著在抗體分子上，對信號水平設置了上限；（2）質譜流式細胞儀的吞吐量被限制在1 000個細胞/s左右，細胞注射和清潔程序比較耗時，增加了每份標本的運行時間；（3）無法運用傳統流式中的前向散射、側向散射功能（用來測量細胞大小和粒度），也不可以回收分選的細胞用于隨后的功能分析；（4）使用成本較高。

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隨著CyTOF的生產、更新以及所能得到的更廣更深的數據結果，越來越多的學者研究相關技術或使用該技術應用于各個領域并發表文章。其中最多涉及的學科為免疫學，其次為生物化學、腫瘤學、血液學、遺傳學及藥理學等。目前，應用質譜流式細胞儀所發表文章大部分來自于美國斯坦福大學的NOLAN實驗室及BENDALL實驗室。他們重點聚焦研究人類造血和免疫系統，進行了骨髓造血細胞亞群分析［1］、樹突狀細胞亞群分析［7］、B細胞分化過程分析［8］、細胞毒T細胞分化及亞群分析［9］等；以及在健康或者疾病狀態下的細胞內信號調控機制。同時，他們也在質譜流式細胞儀使用功能提升方面做了相關研究［4，10］。

（一）免疫學相關應用

通過檢測多標記組合，CyTOF能夠幫助發現潛在的有關鍵功能的細胞群體；或獲得對患者免疫系統狀態的全面視圖，展示免疫細胞的發育和信號傳遞的復雜性。最早使用這項技術的是Bendall等將CyTOF應用于健康人骨髓造血細胞，構建出造血分化模型，并探索不同免疫細胞亞群在藥物干預下的不同反應［1］。CyTOF也可以幫助對各免疫細胞進行精確分型和亞群分析。2014年Bendall等［11］針對健康人骨髓中B細胞發育進行研究，確定了不同成熟階段的細胞信號、增殖和細胞死亡的協調點；并發現一種新的細胞亞群。應用CyTOF研究各類免疫細胞集群（亞群）、分析細胞內信號變化，都是基于對免疫細胞上各類特異性標記物和細胞內表位的認識上，因而對健康和病理狀態下人體免疫系統的細胞圖譜以及信號網絡有了更深的理解，這樣的流程可以應用于各類疾病，例如Winkels等［12］應用單細胞測序和質譜流式技術建立動脈粥樣硬化免疫圖譜；Mrdjen等［13］應用質譜流式與基因定位系統，來識別、定位和表征哺乳動物中樞神經系統中的多個不同的免疫群體。

（二）腫瘤學相關應用

CyTOF在腫瘤學科的應用，主要在兩個方面：一是揭示腫瘤和免疫微環境的組成，并確定新的免疫治療靶點和治療反應的生物標志物；二是了解單個癌細胞內的信號網絡［5］。在腫瘤相關研究中，大多是使用精心設計的20~40個標記組成的面板，分選出各個細胞亞群，并根據特異性表達標記檢測和挑選出關鍵的/罕見的細胞亞型，以揭示腫瘤浸潤的免疫細胞的表型多樣性以及異質性；同時可以比較用藥前后細胞內信號的變化與否，潛在地預測治療反應（疾病預后）或發現藥物敏感或耐藥的機制。例如在一研究高級別漿液性卵巢癌中發現，共表達波形蛋白/cMyc/HE4的細胞亞群可能與預后以及鉑類耐藥的機制相關；在一研究早期肺腺癌中，繪制了與早期肺腺癌相關免疫圖譜，并發現Foxp3+/CD3比率可能是早期腫瘤復發的有力預測因子［14, 15］。通過了解或改造那些關鍵細胞亞型群體與疾病的關系以及腫瘤組織的微環境浸潤等信息，可以更好地了解癌細胞動力學并設計更有效的治療策略。此外，由于獲得腫瘤標本和制備可行的單細胞懸液在實體腫瘤中較“液體腫瘤”更加困難，CyTOF在固體組織和腫瘤的研究中尚未得到廣泛的應用。目前的解決辦法包括將福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織分解成單個細胞，對此進行質譜流式分析，或它們可以直接用于另外的新技術，例如成像質譜細胞術、組織單上皮細胞內信號解聚與質譜術［16］。而制備單細胞懸液則應進行精心設計、控制良好的研究，設計和優化解聚和存儲方案［5］。

（三）血液學相關應用

質譜流式在血液學中的應用與在免疫學和腫瘤學中類似。較早應用CyTOF分析血液學疾病的仍是Nolan和Bendall實驗室的一批人，他們同時分析了白血病細胞的表面和內信號特征，提供了兒童急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）主要表型的全面概述，明確描述了腫瘤異質性。并發現在健康標本中表現出的細胞表面和細胞內信號間緊密的協同調節，在AML中被打破，因而通常用于診斷的表面標記不能可靠地反映AML的細胞狀態和功能［17］。類似流程的研究例如Edwards等［18］報道集落刺激因子1受體可以作為AML的一個新的治療靶點，并提供了其中旁分泌細胞因子/生長因子信號轉導機制，結合其他技術提示集落刺激因子1受體細胞可能是一腫瘤亞群細胞。Kordasti等［19］研究發現調節性T細胞（regulatory cells，Treg）亞群可以作為特發性再生障礙性貧血對免疫抑制治療反應的預測標志物，并且發現特發性再生障礙性貧血患者的Treg在體外對白細胞介素-2敏感且可擴展，這提示了一種新的治療方法。除了在診斷、治療方面的用途，質譜流式也可用于預后評估。一研究使用質譜流式同時量化了標本中涉及B細胞發育的35種蛋白，然后每一個白血病細胞被匹配到它最近的健康B細胞群。通過機器學習確定了6個特征以預測患者復發的可能性，這個模型被稱為“發展依賴復發預測器”，顯著改善了目前建立的風險分層方法［20］。

（四）藥物相關應用

細胞的異質性及其相互之間的相互聯系是藥物開發中的主要挑戰，CyTOF使研究人員能夠在單細胞水平上測量藥物的效果，并更好地了解其作用機制。具體來說，在臨床前研究中，質譜流式可以通過評估全血、組織或其他基質中不同細胞群體的免疫表型來評估藥物的免疫毒理學；例如Sharma等［21］指出抗CTLA-4治療黑色素瘤后，不會引起Treg細胞的下降并能引起CD4+及CD8+T細胞的升高。在臨床研究中，它可用于安全性、受體結合率和藥效學的評估，并可用于研究毒性的作用機制［22］。此類研究多與免疫治療相關，例如在肝癌細胞系和原位腫瘤小鼠的研究中，發現MET可介導GSK3B磷酸化并激活，導至PD-L1表達下降。抗PD-1和抗PD-L1與MET抑制劑聯合使用可產生抑制小鼠肝細胞生長的作用［23］；在黑色素瘤的研究中，發現抗CTLA-4和PD-1聯合治療效果大于單一治療，CTLA-4和PD-1雙重阻斷治療可以引起獨特的細胞反應［24］。此外，最近提出將成像質譜細胞術運用于藥物篩選，成像質譜細胞術數據擴展了單細胞中測量參數的數量，并將高維分析引入早期先導化合物發現的細胞篩選領域［25, 26］。

（五）其他學科應用

質譜流式對于免疫系統的多參數檢測的貢獻很大，而免疫系統參與各科疾病和健康恢復的過程當中，因而與免疫相關的各學科研究均有該技術的發展前景。值得注意的是免疫系統以外的靶細胞與特異性抗體結合后的應用質譜流式的相關研究；例如Porpiglia等［27］的一項研究中應用質譜流式同時分析細胞表面標記和關鍵的生肌轉錄因子，描繪出在活體骨骼肌中從干細胞到祖細胞的成肌過程，并證明這些祖細胞來源于Pax7+干細胞，在體外和體內均可表現出生肌功能。因此，找到感興趣的抗體標記并與其他多種標記共同分析大量的單細胞是應用質譜流式的關鍵一環，在此基礎上綜合蛋白表達、信號變化，構建細胞圖譜和細胞內信息網絡，發現其中的共性或差異性以探索新的潛在的位點并運用到臨床診斷、治療、預后等各階段的研究當中。

質譜流式細胞技術結合質譜和流式細胞技術，大大增多了可檢測的參數，并無需補償，彌補了熒光流式技術上的不足。不過，質譜流式吞吐量小、細胞利用率低、金屬同位素靈敏性較低等的不足是該技術今后需努力提升的重點。在應用上，質譜流式基于多種細胞表面以及胞內表位蛋白質及其特異性抗體，能在同一標本中同時測量這些生物標志物，以區分出多種細胞群體及亞群、構建細胞內信號網絡。類似的工作流程可以構建健康狀態或疾病狀態的細胞圖譜、探索與疾病相關的關鍵細胞（亞）群或信號通道、挖掘藥物或其他刺激下的細胞行為反應、發現可能與預后相關的因素，因而在臨床病因、機制、診斷、治療、預后等各步驟的研究中均有應用價值。而這種多參數的模式尤其適用于免疫學、腫瘤學、血液學、藥物學、分子生物學等學科的研究中。然而，質譜流式技術對每種蛋白質特異的可靠抗體的依賴在一定程度上也限制了發現感興趣的新蛋白質的效用。總之，質譜流式技術幫助研究工作者更展開更精細的研究，挖掘更深層的信息，從而能夠在宏觀及微觀框架下表現出不同的研究效果。