MSI檢測位點的正確姿勢

微衛星不穩定（MSI）相信大家都不陌生，它在結直腸癌、子宮內膜癌、胃癌等多個實體瘤中都是非常重要的分子生物標志物。MSI具有多個臨床價值，包括：

（1）II期MSI-H結直腸癌患者的預后較好；

（2）II期MSI-H結直腸患者無法從5-氟尿嘧啶輔助化療中獲益；

（3）MSI檢測能夠輔助診斷林奇綜合征；

（4）MSI狀態可預測免疫治療療效。

目前市面上已經有多個MSI商用試劑盒出現，各種Panel讓人眼花繚亂，位點選擇也是參差不齊。人類基因組中多如牛毛的微衛星位點，到底應該選擇哪些微衛星進行檢測才是更靠譜的？位點的選擇是否已經有標準可供參考呢？我們今天就來一探究竟。

微衛星（Microsatellite，MS）是指人類基因組中的短串聯重復序列（Short tandem repeat，STR），包括單核苷酸的重復、雙核苷酸的重復，甚至更多核苷酸的重復。

微衛星不穩定（Microsatellite instability，MSI）是指相對于正常組織，腫瘤組織的微衛星由于重復單元的插入或缺失而造成微衛星任意長度的改變。

MSI的發現要追溯至1993年，Aaltonen et al.在《Science》上報道該團隊發現遺傳性非息肉病（Hereditary non-polyposis colorectal cancer，HNPCC）中MSI的發生率高達86%，而散發性結直腸癌MSI的發生率為16%。同一期的該期刊中，Thibodeau et al.也發現28%結直腸癌患者的腫瘤中發生了MSI的現象，同時發現MSI多發于近端結腸且與患者生存期延長呈顯著相關。這些發現開啟了腫瘤生物學和癌癥易感性患者臨床管理的新篇章。

MSI是錯配修復系統（Mismatch repair，MMR）蛋白功能異常所導至的。在微衛星區域中，DNA復制時聚合酶在這些高度重復序列上容易滑脫，導至DNA合成出現錯誤。正常細胞中MMR系統可以識別并修復這些錯誤，而腫瘤細胞中MMR系統功能出現異常，無法識別和修復DNA在復制過程中產生的錯誤，因此DNA中的錯誤加速累積進而導至MSI的現象（圖 1）。同時，研究中發現MSI的現象不僅僅存在于結直腸癌中，而是廣泛的存在于多種腫瘤中，如子宮內膜癌、胃癌等。

 圖 1

目前檢測MSI的金標準是PCR+毛細管電泳法，通常是用PCR方法同時對待測的腫瘤組織和正常組織的微衛星位點進行擴增，再通過毛細管電泳對擴增產物進行DNA片段分析。比較腫瘤組織和正常組織的基因圖譜，如果腫瘤組織的五指峰相較于正常組織的五指峰發生了位移，則該微衛星位點不穩定。

20世紀90年代初，隨著MSI的發現，陸陸續續相關的研究如雨后春筍般涌現出來，備受業界關注。因此，1997年美國國家腫瘤研究所(National Cancer Institute，NCI)對MSI檢測位點的選擇和診斷標準進行了規范和統一。

1997年NCI 舉辦的MSI研討會上推薦的是一個簡稱為“2B3D”的NCI Panel，它包括5個微衛星位點，由2個單核苷酸位點（BAT-25和BAT-26）和3個雙核苷酸位點（D2S123、D5S346和D17S250）組成。同時，專家組也制定了該Panel的診斷標準：若這5個微衛星位點中有2個或2個以上的微衛星不穩定，則判定為MSI-high（MSI-H），若有1個微衛星不穩定，則判定為MSI-low（MSI-L），若5個微衛星位點均穩定，則為微衛星穩定（Microsatellite stable，MSS）（圖 2）。

圖 2

直至今日，這個“2B3D”的NCI Panel在全球范圍內都是最權威的檢測標準。《中國臨床腫瘤學會（CSCO）結直腸癌診療指南 2019版》、《結直腸癌分子標志物專家共識》（2018）、《遺傳性結直腸癌臨床診治和家系管理中國專家共識》（2018）及《ESMO共識：腫瘤免疫治療中的微衛星不穩定檢測建議及其與PD-1/PD-L1表達和腫瘤突變負荷的關系》（2019）等多個國內外指南和共識均明確推薦用“2B3D” NCI Panel進行MSI檢測。

在2002年，NCI舉辦的第二次HNPCC研討會上對MSI的檢測進行了修訂和補充，除了可以選擇”2B3D”NCI Panel之外，當時還推薦了另一個由5個單核苷酸微衛星位點構成的Pentaplex Panel，包括BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-22、NR-24。有研究提示由于”2B3D“NCI Panel中含有3個雙核苷酸的位點，導至其敏感性低于5個單核苷酸位點的Pentaplex Panel。

我們可以看出其實MSI算是一個歷史比較悠久的Biomarker，而隨著時間的推移，它不僅沒有被新的Biomarker所取代，反而在腫瘤精準醫療中的地位越來越重要，原因就是近年來免疫治療的橫空出世又讓MSI火了一把。

2015年，Le et al.首次在NEMJ雜志上報道了MSI-H/dMMR的晚期結直腸癌患者接受帕博利珠單抗（PD-1抑制劑）的療效顯著優于pMMR患者，證明了MSI-H/dMMR的狀態可以預測PD-1抑制劑的療效。

2017年同一團隊又將此研究擴展到了12個不同的癌種中，結果顯示MSI-H/dMMR的狀態可以預測多個癌種中的帕博利珠單抗療效（圖 3）。基于此，2017年帕博利珠單抗獲得FDA加速批準用于經治進展的不可切除或轉移性的MSI-H/dMMR實體瘤患者，這也是FDA首次不依照腫瘤來源，而是依照生物標志物進行區分的抗腫瘤療法。在這個腫瘤精準醫療的時代，它具有里程碑式的意義，也代表人類對腫瘤的認識更上一層樓。

緊接著于2017和2018年，基于Checkmate-142的研究結果，納武利尤單抗單藥(PD-1抑制劑)和納武利尤單抗聯合低劑量伊匹木單抗(CTLA-4抑制劑)獲得FDA批準用于既往治療過的MSI-H/dMMR轉移性結直腸癌患者。

多個MSI相關的免疫治療臨床研究均采用了金標準—PCR擴增+毛細管電泳法，對MSI進行檢測。Checkmate-142（納武利尤單抗）和正在進行的德瓦魯單抗（Durvalumab）和阿維魯單抗（Avelumab）的II期臨床研究（NCT03435107和NCT03150706）選用的是“2B3D”NCI Panel對MSI狀態進行評估。另外，Keynote-016和Keynote-059（帕博利珠單抗）臨床試驗選用的是美國Promega公司的MSI檢測Panel，它包括BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、MONO-27及兩個用于質控的五核苷酸重復位點PentaC和PentaD，有研究提示該Panel在歐美人群中的敏感性高于 “2B3D”NCI Panel。

圖 3

目前，國內市面上的MSI商用試劑盒位點選擇各不相同，可以說是五花八門。比如有一個包含6個位點的Panel：NR-21、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26 和 MONO-27，其位點的選擇并沒有參考權威標準的推薦。該Panel宣稱其中的部分位點是參考國外的檢測，其他位點是適合于中國人群的位點。但是我們并沒有看到這6個位點在中國人群中的驗證結果，性能沒有經過驗證的Panel是無法用于臨床MSI檢測的。

試問，不參考權威指南和共識推薦卻自行選擇微衛星位點的MSI試劑盒，它們的位點有沒有經過嚴格的篩選？位點選擇是不是有據可循？特異性、敏感性有沒有在中國人群中進行驗證？如果沒有，這無疑是在拿腫瘤患者的生命開玩笑，是極其不負責任的做法！這樣的試劑怎么可能給腫瘤患者提供一個準確的檢測結果？

中國人群需要中國人群自己的數據來證實。

在過去的很長一段時間里，幾乎所有的MSI相關研究都是基于歐美人群的，近些年才陸陸續續有來自于中國人群的MSI研究，這些研究發現中國人群和歐美人群的MSI發生率是存在差異的。國內外多個研究顯示中國人群的MSI的發生率約為4%-13%，略低于歐美人群的MSI發生率8-20%，而埃及人的MSI發生率高達37%，因此MSI的發生是存在人種差異的。

近期，也有研究在中國人群中對比“2B3D”和Promega這兩個Panel，一項于2017年發表在Future Oncology上的國內多中心研究結果表明，對于東亞裔人群的結直腸癌患者，“2B3D” NCI Panel靈敏度（87.3%）高于Promega（71.4%）（圖 4）。2019年發表在Cancer Medicine上的另一項國內多中心研究，也得到了同樣的結果(87.18% vs 77.78%)（圖 5），提示“2B3D” NCI Panel可能更適合于東亞裔人群。

圖 4

圖 5

綜上所述，檢測位點的正確姿勢就是參考國內外的指南和共識中推薦的“2B3D” NCI Panel和Pentaplex Panel，且有研究提示“2B3D”NCI Panel在中國人群中敏感性更高，可能更適合中國人群。

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