分子生物學實驗基礎知識

分子生物學是在生物化學基礎上發展起來的，以研究核酸和蛋白質結構、功能等生命本質的學科，在核酸、蛋白質分子水平研究發病、診斷、治療和預后的機制。其中基因工程（基因技術，基因重組）是目前分子生物學研究熱點，這些技術可以改造或擴增基因和基因產物，使微量的研究對象達到分析水平，是研究基因調控和表達的方法，也是分子水平研究疾病發生機制、基因診斷和基因治療的方法。轉化（transformation）、轉染、轉導、轉位等是自然界基因重組存在的方式，也是人工基因重組常采用的手段。基因重組的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解為以一分子基因為模板擴增得到的與模板分子結構完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混雜的目的基因易于純化，得以增量，便于分析。
外來基因引起細胞生物性狀改變的過程叫轉化（transformation），以噬菌體把外源基因導入細菌的過程叫轉染（transfection）。利用載體（噬菌體或病毒）把遺傳物質從一種宿主傳給另一種宿主的過程叫轉導（transduction）。一個或一組基因從一處轉移到基因組另一處的過程叫轉位（transposition），這些游動的基因叫轉位子。

一、基因工程的常用工具

（一）載體
載體（Vector）是把外源DNA（目的基因）導入宿主細胞，使之傳代、擴增、表達的工具。載體有質粒（plasmid）、噬菌體、單鏈絲狀噬菌體和粘性末端質粒（粘粒）、病毒等。載體具有能自我復制；有可選擇的，便于篩選、鑒定的遺傳標記；有供外源DNA插入的位點；本身體積小等特征。
質粒存在于多種細菌，是染色體（核）以外的獨立遺傳因子，由雙鏈環狀DNA組成，幾乎完全裸露，很少有蛋白質結合。質粒有嚴緊型和松弛型之分。嚴緊型由DNA多聚酶Ⅲ復制，一個細胞可復制1-5個質粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ復制，一個細胞可復制30-50個質粒，如果用氯霉素可阻止蛋白質合成，使質粒有效利用原料，復制更多的質粒。質粒經過改造品種繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。這些質粒都含有多個基本基因，如復制起動區（復制原點Ori），便于復制擴增；抗抗生素標記（抗氨芐青霉素Apr、抗四環素Tcr等）或大腸埃希菌部分乳糖操縱子（E.coli LacZ）等，便于基因重組體的篩選；基因發動子（乳糖操縱子Lac、色氨酸操縱子Trp等）和轉錄終止序列，便于插入的外源基因轉錄、翻譯表達。質粒上還有許多限制性內切酶的切點，即基因插入位點，又叫基因重組位點，基因克隆位點。
常用噬菌體載體有單鏈噬菌體M13系統；雙鏈噬菌體系統。噬菌體應和相應的宿主細胞配合使用。以上載體各有特點，便于選擇，靈活應用。

（二）工具酶
工具酶是基因重組技術不可缺少的工具。主要有限制性內切酶、連接酶、核酸聚合酶、逆轉錄酶、核酸酶等。
限制性內切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA內切酶之分，Ⅱ型能嚴格識別核酸序列，并在識別區內特定的核苷酸處切開DNA雙鏈。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA內切酶。識別分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋轉對稱。切口分開端和粘端，產生3′－OH和5′－P末端。內切酶品種多，使用時應注意溫度、緩沖液用量（一般1μg DNA/2-5單位酶）等反應條件。