土壤的分子生物學特性介紹

在我們的實驗室里，zui難搞的樣品類型之一就是土壤。在開發提取土壤中微生物DNA、RNA的試劑盒和構思提取方法的過程中，我們需要收集記錄大量各種類型土壤的有機物含量、質地、pH以及采集地。這些因素與土壤微生物含量息息相關，同樣地也影響著提取DNA、RNA的得率。

下文，我將介紹一些影響土壤DNA、RNA提取的關鍵問題。

腐植酸(Humic substances）：

困擾提取土壤DNA和RNA的zui大問題是其中的腐植質含量（腐植酸、黃腐酸等腐殖質）。腐植酸由有機物降解形成（植物、微生物等殘骸），并使得土壤呈黑顏色（苯醌基的分子結構）（1）。腐植酸分子都含有羧基和酚基，分子量大小不一。分子間抱團螯合成大分子多價陽離子，使得其非常利于微生物和植物的再次吸收利用（2）。有關腐植質更多詳細介紹，請點擊這里

因為腐植酸、黃腐酸與DNA、RNA一樣都是大分子親水性陰離子聚合物，很容易在zui后步驟跟核酸一起被抽提出來。所以在zui終洗脫核酸前把他們去除掉。

IRT技術（Inhibitor Removal Technology）：

抑制因子去除技術是MO BIO從土壤樣品中去除多苯多酚腐殖質的一項技術。該技術的工作原理是通過改變pH值先溶解后沉淀蛋白等大分子物質。核酸在這個過程中不會被沉淀，從而分離去除掉抑制因子。該技術同樣適用于血液中的亞鐵血紅素和糞便樣品、皮膚中的黑色素、法醫樣品中染血衣服上的染料。

微生物細胞裂解（Lysis of microorganisms）:

去除抑制因子是困難的*步，而裂解土壤中的微生物細胞則是第二步。否則沒法準確描述土壤微生物結構情況。機械裂解法可以快速有效地裂解土壤中的細菌和真菌。我們實驗室更喜歡用Vortex Genie 2 ，因為它有比強力高速珠磨研磨機所沒有的優勢。

宏基因組學（Doing metagenomics）?

使用渦旋儀(Vortex)zui大的一個好處就是，它長達10分鐘相對輕柔的作用力破碎細胞可以得到更大分子量的DNA。低速轉動過程中產生很少的熱量，避免過多熱量積聚引起的DNA、RNA降解。配合使用MOBIO的裂解緩沖液，可以更大限度減少DNA、RNA的破損，保障核酸分子完整性。 裂解緩沖液也是IRT技術的一部分。宏基因組學要求大分子量DNA，故渦旋儀(Vortex)是的選擇。

節省經費？

渦旋儀體積小價格便宜，特別適合經費有限的實驗室，也特別適合在野外搭建臨時實驗室。渦旋儀重量輕，zui多還能一次處理24個樣品。MOBIO 已經開發出一系列用在Vortex Genie 2.上的適配器（Vortex adapters），適應各種大小的Tube管。

更強的裂解?

渦旋儀和我們的其它溶液足可以裂解絕大部分生物體，而對于一些真菌孢子類則需要更強力的裂解。對于這類樣品，我們建議在渦旋振蕩前加入加熱步驟。就是加樣后在65℃~70℃孵育10-15min（4,5）。另一個可選方法是渦旋振蕩前反復多次凍融。這些加強的裂解足可以對付堅硬的孢子、真菌細胞。

高速珠磨研磨機如何？

高速珠磨研磨機有時是對付堅硬生物體的有效手段，但過高的速度會過分剪切DNA，產生的熱量也會加速RNA的降解。在我們的實驗室里，通過凝膠電泳并沒有觀察到使用高速珠磨研磨機對DNA得率有所貢獻。反而Nanodrop 的分光光度計在260nm讀數偏高，意味著DNA破損嚴重。（核酸蛋白定量儀）。使用平板培養計數存活的細菌，發現使用渦旋儀和Precellys出來的結果差不多。不過高速珠磨研磨機Precellys增加了植物和昆蟲DNA的釋放，稀釋了微生物DNA所占的比例。實驗過程中應該盡量避免。