1.細胞的破碎
當待測組分(主要是各種多肽激素、各種酶以及各種基因工程的產物如胰島素、生長激素等)存在于生物體細胞內及多細胞生物組織中時,需在分析測定之前將細胞和組織破碎,使這些待測組分充分釋放到溶液中去,不同的生物體或同一生物體的不同組織,其細胞破碎的難易程度不一樣,使用的方法也不完全相同。如動物胰臟、肝臟、腦組織一般比較柔軟,用普通的勻漿器研磨即可,肌肉及心臟組織較韌,需預先絞碎再作成勻漿。植物肉組織可用一般研磨方法,含纖維較多的組織則必須在搗碎器內破碎或加砂研磨。許多微生物均具有堅韌的細胞壁,常用自溶、冷熱交替、加砂研磨、超聲波和加壓處理等方法。總之,破碎細胞的目的就是為了破壞細胞的外殼,使細胞內含物質釋放出來,獲得有效的提取。
除了上述一些方法外,目前人們仍在探尋新的多細胞破碎方法。下面介紹幾種在實驗室中常用的破碎方法
(1)機械法
機械法主要是通過機械切力的作用使組織細胞破碎,有以下幾種裝置和方法可用于組織細胞的破碎。
①高速組織搗碎機 由調速器、支架、馬達、帶桿刀葉、有機玻璃管(筒口加蓋)等部分組成,操作時將樣品配成稀糊狀液,放置于筒內(約占1/3體積),固定筒上的蓋子,將調速器撥至最慢處,開動馬達后逐步加速至所需速度,一般市售商品轉速最高可達20000r/min。高速組織搗碎機適宜于動物內臟組織、植物肉質種子、柔嫩的葉和菜籽材料的破碎。
②玻璃勻漿器 由一個內壁經過磨砂處理的玻璃管和一根一端為球狀(表面經過磨砂)的桿組成。操作時,先把絞碎的組織置于管內,再套入研磨桿,手工來回研磨,或把桿裝在電動攪拌器上,用手握住玻璃管上下移動,即可將細胞研碎。勻漿器的內桿球體與管壁之間一般只有十分之幾毫米,細胞破碎程度比高速組織搗碎機高,機械切力對生物大分子破壞較少。制造勻漿器的材料除玻璃外,也可是不銹鋼、硬質塑料等。
③研磨 常用的有研缽和研磨。細菌及植物材料應用較多,加入少量的玻璃砂效果更好。
(2)物理法
物理法主要通過各種物理因素的作用使組織細胞破碎,常用的有以下一些方法。
①反復凍融法 把待破碎樣品冷至20-15℃使之凍固,然后緩慢融化,如此反復操作,大部分動物細胞及細胞內的顆粒可被破碎。
②冷熱交替法 在細菌或病毒中提取蛋白質和核酸時可使用此法。操作時,將材料放入沸水中,在90℃左右維持數分鐘,立即置于冰浴中,使之迅速冷卻,絕大部分細胞被破壞。
③超聲波處理法 此法多用于微生物材料,處理效果與樣品濃度及使用頻率有關。用大腸桿菌制備各種酶時,常選用50～100mg/ml菌體,在1～10kMz頻率下處理10～15min。
(3)化學及生物化學法
主要是通過化學試劑或酶破壞細胞壁而使細胞破碎,常用的有如下一些方法。
①自溶法 將待破碎的新鮮生物樣品存放在一定pH值和適當的溫度下,利用組織細胞中自身的酶系將細胞破壞,使細胞內含物釋放出來的方法。自溶的溫度,動物樣品常選在0~4℃,微生物材料則多在室溫下進行。自溶時,需加少量防腐劑如甲苯、氯仿等以防止外界細菌的污染。
②溶菌酶處理 溶菌酶可用蛋清或微生物發酵方法制得,具有專一地破壞細菌細胞壁的功能。如用噬菌體感染的大腸桿菌細胞制備DNA時,采用pH8.0、0.1mol/L Tris-0.01mol/L EDTA制成每毫升2億個左右細胞的細胞懸液,然后加入100pg～1mg的溶菌酶,37℃ pH8.0條件下保溫10min,細胞壁即被破壞。溶菌酶作用專一性強,適用于多種微生物,人們較喜歡使用。除溶菌酶外,蝸牛酶、纖維素酶也常被選為破壞細菌及植物細胞之用。
③表面活性劑處理法 較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉等。
除上述方法外,通過改變細胞膜透性,破壞蛋白質與脂類的結合,也可達到破壞細胞的目的,有利于蛋白質、酶等物質的分離提取。這方面應用較多的有真空干燥和用丙酮處理制成丙酮粉的方法。在酶的制備中,用丙酮干燥,不僅是使細胞膜破碎的有效方法,而且可做成具有酶活力的干粉長時間保存,作為一個很方便的原料樣品在需要分析測定時以水或緩沖液把酶提取出來。無論用哪一種方法破碎組織細胞,都在一定的稀鹽溶液或緩沖溶液中進行,一般還需加入某些保護劑,以防止生物大分子的變性及降解。