(一)標本的采集
常用于基因擴增檢測的臨床標本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時,應使用一次性密閉容器,如真空采血管。當使用非密閉采樣系統時,如尿、分泌物和骨髓的采樣,必須注意防止來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時必須戴一次性手套。
玻璃器皿在使用前應高壓處理,因為玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是熱滅菌,250℃烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。
全血和骨髓標本必須進行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝,因為肝素是Taq酶的強抑制劑,而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。
臨床用于RNA(如HCV RNA)擴增檢測的血標本建議進行抗凝處理,并盡快(3小時以內)分離血漿,以避免RNA的降解。如未作抗凝處理,則抽血后,必須在1小時內分離血清。
(二)標本的穩定化處理
用于DNA擴增檢測的標本,采集后一般不需要特殊的穩定化處理,但標本應及時送至實驗室。
由于RNA易受RNA酶的降解,因此用于RNA測定的標本有時必須進行穩定化處理,如流行病學調查的現場采樣。異硫氰酸胍鹽(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活,因此在采集標本時,可將標本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的試管中,從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。經上述穩定化處理后,標本一般不需要冷藏即可郵寄。對于特定的檢測項目,上述穩定化處理方法的效果究竟如何,要使用相應的逆轉錄PCR測定方法來評價。
(三)標本的運送
標本采集后必須盡快送至實驗室。經過適當穩定化處理的標本可在常溫下通過郵寄運送。如用于DNA擴增檢測的EDTA抗凝全血標本及用于RNA擴增檢測的經GITC穩定化處理的標本。通常在運送時,應采用不易破碎的容器裝載標本。用于RNA檢測的標本,如果未經穩定化處理,則必須速凍后,放在干冰中運送。
(四)標本的貯存
臨床體液標本如血清/血漿等可于-70℃下長時間貯存。用于DNA測定的已純化核酸樣本可在10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA緩沖液(pH 7.5-8.0)中4℃保存。用于RNA測定的已純化核酸樣本應在緩沖液中-80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20℃即可。用GITC處理的RNA標本在室溫可保存7天。
(五)標本的處理(核酸提取)
標本處理即核酸提取純化是決定擴增檢測成敗的關鍵性步驟,在使用商品核酸提取試劑提取臨床標本中的核酸模板前,應對其進行充分評價以驗證其提取的有效性。通常,核酸制備質量不高是由于抑制物去除不完全所致,抑制物可能來源于標本本身(如血紅素及其前體或降解產物)或核酸提取過程中殘留的有機溶劑(如酚、氯仿等),這些物質對其后的Taq酶擴增反應步驟具有強烈的抑制作用,從而影響靶核酸的擴增測定。當標本為痰時,則必須先進行液化處理,再提取核酸。需注意的是,液化時不能加熱,液化時間不能過長。此外,當靶核酸為RNA時,逆轉錄PCR測定失敗的常見原因是標本在運送前未經充分的穩定化處理及核酸提取試劑的RNA酶的污染。對于前者,要核查測定分析前的步驟,如果發現有RNA降解的證據,實驗室則應拒絕接受標本,要求重新采取標本,并對運送者給以詳細的指導。對于后者,建議使用高質量的商品核酸提取試劑。
(六)靶核酸的逆轉錄(RT)和擴增
1、靶RNA的逆轉錄
cDNA合成為逆轉錄PCR中的第一個酶反應步驟,所產生的cDNA為靶RNA的反向互補鏈,為后面擴增的模板。下述因素通常影響cDNA合成的效率:(1)逆轉錄效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆轉錄酶質量不高、試劑降解變質或加樣錯誤等；(2)用于逆轉錄的標本中存在逆轉錄或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血紅素等)；(3)RNA酶的存在導致RNA的降解。
2、核酸的擴增
有多種因素可引起核酸擴增檢測的假陽性或假陰性結果,如擴增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對、Mg++濃度不佳、患者標本或試劑受污染等。擴增儀孔中熱傳導的均一性極為重要,必須定期對擴增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導的一致性進行檢查,以避免假陰性結果。
(七)污染
在實際工作中,常見有以下幾種污染類型:擴增片段的污染(產物污染)；天然基因組DNA的污染、試劑污染(貯存液或工作液)以及標本間交叉污染(如氣溶膠從一個陽性標本擴散到原本陰性的標本)。臨床基因擴增檢驗實驗室中污染的最主要來源是擴增產物的污染。