由于高速逆流色譜是無需任何固態載體支撐的液-液色譜,其中作為固定相的液體在色譜柱中的保留程度對于高速逆流色譜的分離過程是十分重要。首先，所選擇的溶劑體系對固定相保留率有很大的影響，如兩相密度差、粘度、界面張力等。兩相的密度差對固定相保留率的影響最大，固定相保留率和密度差基本呈線性關系。其次，還存在一些人為可以操控的條件會對固定相保留率產生影響，如高速逆流色譜的轉速、流速、以及柱溫等。其中，螺旋管柱的轉速以及它產生的離心力場對兩相的混合程度具有決定性的影響。因此，對于界面張力較高的溶劑系統，應使用較高的轉速，以使兩相之間能夠劇烈的混合，從而促進分配和減少質點傳遞的阻力。對于界面張力較低的溶劑系統，應使用較低的轉速，以避免過分混合引起乳化作用，以及固定相的流失。
在流動相流速方面，固定相保留率與流速平方根之間有著線性關系。流動相流速快不利于固定相的保留，且出峰時間太快會導致峰與峰間的分離度較差，而低流速雖然可以滿足提高固相保留率的要求，但是分離時洗脫時間太長，且峰形變寬、耗費大量的流動相，故選擇合適的流速對整個分離體系非常重要。
儀器的柱溫對固定相的保留同樣也有著不可忽視的作用，其溫度對于親水性強的正丁醇溶劑體系的固定相保留率影響較大。同時溫度升高能改變溶劑的粘度，進而影響兩相的分層時間。
在選定了溶劑體系后, 有時需要對三個儀器運行參數(轉速, 流動相流速, 進樣體積)進行正交試驗, 以確定最佳分離條件。分離是一種較為復雜的動態高速分配過程，其分離效率不僅和溶劑系統有關，還受分離溫度、螺旋管轉速、流動相流速、梯度洗脫模式及進樣量、進樣方式等因素的影響。