蘇氨酸蛋白酶使用其N端蘇氨酸的仲醇作為親核試劑進行催化。蘇氨酸必須是N末端，因為相同殘基的末端胺通過極化有序水而起到一般堿的作用，從而使醇去質子化以增加其作為親核試劑的反應性。
催化分兩步進行：
首先親核試劑攻擊底物形成共價酰基酶中間體，釋放xxx個產物。
其次，中間體被水水解以再生游離酶并釋放第二產物。
在鳥氨酸酰基轉移酶中，底物鳥氨酸（受體）代替水進行第二次親核攻擊，因此與酰基一起離開。
