與細胞核DNA相比，mtDNA作為生物體種系發生的“分子鐘”(molecular clock)有其自身的優點：①突變率高，是核DNA的10倍左右，因此即使是在近期內趨異的物種之間也會很快地積累大量的核苷酸置換，可以進行比較分析；②因為精子的細胞質極少，子代的mtDNA基本上都是來自卵細胞，所以mtDNA是母性遺傳(maternal inheritance)，且不發生DNA重組，因此，具有相同mtDNA序列的個體必定是來自一位共同的雌性祖先。但是，近年來PCR技術證實，精子也會對受精卵提供一些mtDNA，這是造成線粒體DNA異序性(heteroplasmy)的原因之一。一個個體生成時，該個體細胞質內mtDNA的序列都是相同的，這是mtDNA的同序性(homoplasmy)；當細胞質里mtDNA的序列有差別時，就是mtDNA的異序性。異序性對于種系發生的分析研究會造成一些困難。
在分子進化研究中，mtDNA同樣也是十分有用的材料。由于線粒體基因在細胞減數分裂期間不發生重排，而且點突變率高，所以有利于檢查出在較短時期內基因發生的變化，有利于比較不同物種的相同基因之間的差別，確定這些物種在進化上的親緣關系。有人曾從一具4 000年前的人體木乃伊分離出殘存的DNA片段，平均大小僅為90 bp。這對于核基因組來說，這么短的DNA片段很難說明什么問題，可是這是線粒體基因組DNA，就可能是某個基因的一個片段，可以進行比較分析。因此，當前的分子進化生物學的研究，多半是取材于古生物或化石的牙髓或骨髓腔中殘留的線粒體DNA作為實驗材料。
線粒體基因組中的基因與線粒體的氧化磷酸化作用密切相關，因此關系到細胞內的能量供應。近年來發現人的一些神經肌肉變性疾病如Leber氏遺傳性視神經病(主要表現為雙側視神經萎縮引起急性或亞急性視力喪失，還可伴有神經、心血管及骨骼肌等系統異常)、帕金森病、早老癡呆癥、線粒體腦肌病、母系遺傳的糖尿病和耳聾等，都同線粒體基因有關。也有人指出，衰老可能同mtDNA損傷的積累有關。