siRNA表達載體構建好后，即可進行RNA干擾主體實驗。
RNA干擾主體實驗的重點在于：
成功將siRNA表達載體導入目的細胞
如果目的細胞的質粒轉染效率較低（低于70%），則應采用腺病毒或慢病毒載體，利用病毒載體的高感染率、高表達特性，更好地開展RNA干擾主體實驗。
設置好分組和對照
按照nature的標準，一個嚴格的RNAi介導knockdown實驗要有6個對照：
1、轉染試劑對照（監控轉染及培養條件對結果的影響）；
2、nonsense siRNA對照（監控外源核酸本身對結果的影響）；
3、positive siRNA對照（監控假陰性）；
4、技術重復對照（也叫off-target 對照，也就是利用至少2個靶點的siRNA同時實驗，2個siRNA互為off-target control，當兩者的表型相同時，才有可能是特異性的knockdown效應）；
5、rescue 對照（knockdown之后做超表達，看是否有性狀的逆轉，這也是為了說明knockdown的特異性）；
6、全表達組掃描對照（就是轉錄/表達芯片掃描，以最終確定表型不是由于off-target造成）。
實際實驗中，全表達組掃描對照很少有文獻涉及。其它幾個對照中，1、2兩種對照即所謂的空白細胞對照、NC對照，基本是所有雜志都要求具備的。4、5兩種對照，主要是為了解決off-target效應，選做一種即可，一般建議選5，涉及的實驗即所謂的“RNA干擾回復實驗”