腸球菌由于其細胞壁堅厚，對許多抗生素表現為固有耐藥。其耐藥性包括固有耐藥、獲得性耐藥2種。腸球菌對青霉素敏感性較差，對頭孢菌素類耐藥。腸球菌對青霉素耐藥的主要機制為細菌產生一種特殊的青霉素結合蛋白（PBP5），后者與青霉素的親和力減低，從而導致耐藥。此種耐藥以屎腸球菌多見。青霉素不能致腸球菌自溶，因此對腸球菌而言，青霉素為抑菌作用，而非殺菌作用。少數情況下，細菌產生大量青霉素酶而引起耐藥，但通常用頭孢硝噻吩（Nitrocefin）紙片不易獲陽性結果，因此其確切發生率可能被低估。
腸球菌對氨基糖苷類的耐藥性有2種：
①中度耐藥性（MIC62～500mg/L），系細胞壁滲透障礙所致，此種耐藥菌對青霉素或糖肽類與氨基糖苷類合用敏感；
②高度耐藥性（慶大霉素MIC≥500mg/L、鏈霉素≥2000mg/L），系細菌產生質粒介導的氨基糖苷類鈍化酶APH（2”）-AAC（6”）所致，此種耐藥使青霉素或糖肽類與氨基糖苷類的協同作用消失。因此測定氨基糖苷類的耐藥程度，對于臨床治療有重要參考意義。
雖然體外藥敏顯示腸球菌對磺胺甲惡唑-甲氧芐啶敏感，但由于體內腸球菌可利用外源葉酸，故使該藥失去抗菌作用。
腸球菌對萬古霉素的耐藥性有3種：
①VanA型，對萬古霉素、壁霉素均高度耐藥，由位于Tn1546轉座子上的VanA基因編碼；
②VanB型，對萬古霉素呈不同程度耐藥，MIC4～1024mg/L，對壁霉 素敏感，由位于染色體上的VanB基因編碼；
③Van型，由位于染色體上的VanC基因編碼，本型少見且無臨床意義。