如何全面分析分子間相互作用

　　【導語】來自GE醫療集團生命科學部的表面等離子共振技術（Biacore）和微量熱技術（Microcal）的相互補充、相互印證可以為我們正確全面判定分 子間相互作用的全面機制，提供充分的信心：不僅可定量研究結合的快慢（ka\kd，Ka為結合速率常數，Kd為解離速率常數），結合的強弱（K_D\G， K_D 為解離平衡常數，G為吉布斯自由能）；而且可定量研究結合的位點（n），結合的驅 動力及機理（△G\△H\△S，G為吉布斯自由能，H為焓，S為熵），并且可評判結合的穩定性。

　　一說起分子間的相互作用，大家的第一反應往往是親和力。沒錯，親和力確實是判定分子間相互作用的重要參數。它可以幫助我們了解生物學過程和分子識別過程，驅動藥物先導物的發現，并幫助我們選擇最優的生物藥物，優化藥物的安全性和藥效，以及藥物劑型和制造工藝。

　　然而，親和力并不是一切……

同樣的親和力，不一樣的動力學（結合\解離速率）

　　從下圖可以看出，同樣的親和力，卻可以有兩種不同結合、解離速率的動力學過程。這些與速率有關的信息，在藥 品開發中非常有用。例如，人們需要安眠藥物能夠及早發揮效果。如果有多個候選對象藥物，就需要通過Biacore來選擇能從受體中快速解離的藥物。反之， 為了讓抗癌藥物能夠在體內長時間保持藥效，就要選擇解離速度慢而能夠長時間與受體結合的候選藥物。

同樣的親和力，不一樣的熱力學

　　在此，我們有必要先復習一些物理化學的知識。吉布斯自由能是熱力學中的一個重要參數。相互作用中的吉布斯自由能△G，是自發性或有利性的測量。如果△G是負的，則反應是自發的。如果△G是正的，反應不會發生。關于△G，還有一個熟悉的方程式：△G = △H — T△S

　　以下三個不同的化合物結合在同樣的靶標上，它們均具有同樣的親和力或ΔG（見藍色條柱）。如果單以此來評級篩選藥物，它們是完全相同的。但是如果你研究它們各自的結合機理（見紅色和綠色條柱），它們又是完全不同的。

　　A. 結合親和力來自于專有的氫鍵或范德華力的相互作用，表示為焓變ΔH；同時也存在由于構象變化帶來的熵變ΔS。藥物的這種結合模式，表明藥物具有很好的結合 特異性和選擇性，是使藥物成為最佳選擇的好的開端，但是同時由于極性較高（熵變為負），也有容易引起膜透性的問題。

　　B. 結合親和力來自于非特異性的疏水效應，表現為顯著有利的熵變ΔS，同時由于表面無氫鍵形成所帶來的去水合過程需要消耗的不利焓變ΔH。藥物的這種結合模式，說明藥物結合不具有特異性，而且溶解度較差，容易產生副作用和抗藥性。

　　C. 結合親和力來自于有利的氫鍵效應和疏水效應。藥物的這種結合模式是較為理想的：既具有結合作用的特異性，又可以保持一定的膜透性。

　　因此，在目前的藥物設計中，來自于熱力學方面的信息，愈來愈成為一種不可或缺的證據。

測量熱穩定性同樣重要

　　蛋白質等生物大分子及其相關復合體系的穩定性研究是進行相互作用分析的重要基礎之一。分子間相互作用在蛋白 質分子內實際上就是蛋白質結構的穩定性和可折疊性。對于生物功能的信息流動而言，蛋白質天然結構的穩定性和可折疊性是一個重要環節。具有適當初級序列的多 肽鏈折疊成具有生物活性的天然結構，使得從遺傳信息到生物功能的信息表達過程得以完成。在正確的物理化學條件下，蛋白質的折疊是自發的；在不正確的物理化 學條件下，蛋白質通常沒有緊致而特定的結構，也就沒有其生物學功能。

　　在這個意義上，我們說，基因一旦被表達，即被翻譯成一定的多肽序列，熱力學就代替生物學機制起主導作用，將原本是柔性、不規則的多肽鏈折疊為生物學功能所需的、更緊致、特定的結構。

　　下圖反映了我們剛才所說的三個方面，即動力學、熱力學和熱穩定性。若想分析分子間相互作用，我們須全面地了解：分子間是否存在結合（相互作用），結合的快慢、結合的強弱，結合的機理、以及驅動力……

　　所有這些關于分子間相互作用的研究常常采用生物物理的方法來進行，目前應用的一些技術都需要提前對作用的分子進行標記處理，但標記的處理常常會導致分子不是處于真正的原位環境，而且標記的處理會帶來其他無法預測的額外因素，為分子間相互作用的研究增加了難度。

　　來自GE醫療集團生命科學部的表面等離子共振技術（Biacore）和微量熱技術（Microcal）卻很好地克服這些缺陷，它們的特點是：非標記、 原位、微小、靈敏、快速，動態的、全過程地實時、定量表征結合的過程；而且這二者技術得到信息的相互補充、相互印證可以為我們正確全面判定分子間相互作用 的全面機制，提供充分的信心：不僅可定量研究結合的快慢（ka\kd），結合的強弱（ K_D \G）；而且可定量研究結合的位點（n），結合的驅動力及機理 （△G\△H\△S），并且可評判結合的穩定性。所有這些都十分有助于我們的生命科學研究工作者對生命本質的認識。

三大技術平臺

　　若想了解熱穩定性和分子結構的熱容，首選差示掃描量熱儀DSC。該技術通過升高或降低溫度來誘導高分子的改變，從而測量相互作用的熱力學。過去該技術的使用僅限于少數專業科研小組，但現在的儀器使用簡單，只需要適量的物質即可準確地測量，DSC也就成為大部分生物物理學實驗室的常規儀器。

　　使用DSC，你能快速鑒定出最穩定的蛋白質和生物藥物候選物；比較天然、修飾和突變異構體生物分子；在幾天 的時間內優化表達、純化以及制造的工藝；并對各種液體劑型進行簡單、快速的優化和確定。目前，已有成千上百的發表刊物中記錄了蛋白質，核酸和脂質分子穩定 性的DSC表征的結果。

　　表面等離子共振技術SPR是 一項用于測定相互作用動力學和親和力的技術。分子配體（蛋白質、核酸、脂質體、蛋白質膜、碳水化合物、小分子）被固定在傳感芯片的金膜表面。芯片表面與微 通道系統相連接，通過此通道，精確控制流速的緩沖液和樣品流經配體分子固化的表面。固化的分子與在溶液中的樣品（被分析物）能夠在傳感器表面檢測到質量的 變化，這種質量變化是通過表面電漿共振的現象SPR被檢測到的。樣品（被分析物）與配體的結合的相互作用直至達到平衡的隨時間的變化過程被實時記錄下來， 在任何時間，樣品可以被切換成單純的緩沖液，則解離的過程就會隨之而來。從一個或幾個實驗中得到的相互作用圖譜，就可以確定配體分子與樣品結合的親和力、 動力學、選擇性、濃度以及熱力學的信息。

　　等溫滴定量熱法 ITC 同樣能提供大量的生物分子相互作用的追蹤記錄。該技術是以測定注入某種配體后含生物分子的樣品池所釋放或吸收的熱量為基礎，在眾多研究中用于考察突變和溶 液條件改變的影響，以獲得對于相互作用背后的驅動力、驅動因素的全面理解。此外，ITC的應用也不僅限于結合的研究，該儀器還可用于測量和定量諸如酶促反 應的任何熱量改變過程。

　　ITC應用的一大優勢在于其依賴的是熱力學測定，因此采用ITC對天然生物分子進行鑒定的過程中無需引入任何的標記分子。并且該方法也沒有分子量限制，同樣對樣品也沒有光學透明的外觀要求。ITC滴定對于研究單個實驗的結合親和力，結合焓以及相互作用的劑量效應尤其適用。

選擇何種方法進行分析？

　　技術是介紹了，可如何應用呢？讓我們對這些系統進行一個概述：首先啟動差示掃描量熱儀對蛋白和其他生物分子 的穩定性進行表征和鑒定。一旦各個組分之間形成穩定的相互作用，則可啟動表面等離子共振系統即Biacore和等溫滴定量熱法即MicroCal ITC系統對分子之間相互作用的動力學和熱力學進行研究。綜合這些儀器的數據，可詳盡地描述生物分子穩定性和結合的動力學、結合機制，而無需標簽的引入。

　　Biacore? 和MicroCal?系統在功能上互補。一般來說，Biacore建議用于：必須對結合的速度進行分析的系統；樣本量較少的系統；必需有高通量的系統。 MicroCal ITC建議用于：使用熱力學參數進行新藥的分子設計；用現有方法進行固定化較困難的情況；離子等非常小的分子的結合。

　　以下是三個平臺的比較