質譜沙龍第二十三期活動報道

　　2009年10月31日下午，質譜沙龍第二十三期活動在北京大學分析測試中心舉行。本次活動的報告題目非常吸引人，又在條件極佳的北京大學分析測試中心會議室舉行，所以吸引了30余位老師來參加。除了來自中國食品發酵研究院、二炮總醫院、北京大學分析測試中心、AB公司、中科院、中國醫學科學院、北京安貞醫院、中國計量院化學所的老朋友外，還有來自中科院植物所、北京科技大學、中國CDC、西苑醫院、首都師范大學等新朋友。

　　第二十三期質譜沙龍活動現場

　　第二炮兵總醫院藥劑科 李鵬飛 老師主持會議

　　北京大學分析測試中心簡介以及Bruker傅里葉變換高分辨率質譜的應用實例

　　北京大學分析測試中心 周江 博士

　　首先，北京大學分析測試中心的周江博士向大家介紹了北京大學分析測試中心的基本情況以及Bruker傅里葉變換高分辨率質譜的應用實例。

 

　　北京大學分析測試中心簡介

　　北京大學分析測試中心成立于1983 年，前不久搬入了北大化學學院的新樓，占地面積約1,600平方米。中心擁有光譜、質譜、色譜、XRD/能譜、顯微鏡、核磁、元素分析、熱分析等檢測實驗室及總價值約3,000萬元的先進大中型分析測試儀器32臺/套，在化學成分與結構分析方面儀器配套齊全。中心在1993年首次通過計量認證，目前有12臺儀器參與計量認證工作，可向社會相關單位提供公證數據。中心技術力量雄厚，主要測試和服務項目包括無機物和有機物成份與結構分析、表面分析、熱分析和物性測定分析等分析測試服務。2008年，中心為校內測試的樣品比例為92.7%，所有儀器均參加了北京大學校內分析測試基金開放服務，完成基金、校內外測試收入都已經滿足了儀器日常維護運轉的要求。另外，2008年中心技術人員合作研究發表科技論文58篇。中心在對外服務方面，參加了北京地區協作共用網、并加入了首都科技條件平臺開放實驗室，為各兄弟院校、科研院所、冶金、醫藥衛生、材料和食品等部門和行業提供大量可靠的分析測試數據，并獲得了好評。中心在前不久剛剛改版了網站，服務目標是實現網絡化管理，日前，通過登錄北京大學分析測試中心網站，用戶可以網上送樣預約和查詢測試結果。

 

　　FTMS的基本原理和使用技巧

　　周博士本人目前在中心負責傅里葉變換高分辨率質譜(FTMS)，他介紹了FTMS的構造和基本原理、Bruker Data Analysis 軟件的實用功能，總結了使用FTMS的一些技巧，并用5個應用實例舉例了FTMS的強大功能。

　　Bruker 7.0T APEX Ⅳ型傅里葉變換高分辨率質譜儀

　　FTMS儀器的基本原理為：離子經過離子傳輸系統進入離子回旋池，由于受磁場的作用，離子在回旋池中做旋轉運動。旋轉頻率與離子的質荷比成反比，檢測由于離子旋轉而產生的鏡像電流信號，再進行傅立葉變換，就可獲得離子的質譜。由于FTMS的高靈敏度、高精度、高分辨率，再加上Bruker Data Analysis軟件中的Smart Formula功能，在測定化合物時可以準確生成分子式，提供可靠的鑒定結果，質量分析精度可達1.7ppm。

　　接下來，周博士介紹了自己總結的FTMS的一些使用技巧。比如在溶液條件方面，要選擇合適的溶劑，樣品要獲得很好的溶解度，在很多情況下，都可以適當甲酸幫助離子化。而在儀器條件方面，要對離子源的各項參數(比如離子源溫度)進行優化，并選擇合適的校準溶液，使其可涵蓋對應的質量范圍。

 

　　FTMS應用實例1)：未知物及產物的鑒定

　　對于未知物/產物的鑒定，周博士舉了四個實例：a) 利用SmartFormula功能分析質量數小于400且組成元素僅為C、H、N的化合物，分析結果為C₂₁H₂₅N₈；b) 對于EI 204且未知物化學式為C_xH_11-12F_0-1N_xO_2-3，SmartFormula的分析結果為C₁₁H₁₃N₂O₂ 或C₈H₁₄FN₂O₃；c) 對于產物C₉D₆Cl₄O₃的分析結果為C₉H Cl₄D₅NaO₃或C₉ Cl₄D₆NaO₃；d) ESI測定非極性小分子。

 

　　FTMS應用實例2)：非共價相互作用

　　周博士舉了ESI檢測非共價相互作用的實例，并對質量軸范圍不同的檢測結果做了比較，選擇窄的質量范圍可得到高分辨率的譜圖，但是質量范圍過窄，校準物質不好找到，因此，應在有合適校準物的前提下選擇窄的質量范圍。

 

　　FTMS應用實例3)：金屬配合物的確認

　　對于一個金屬配合物，可以通過ESI檢測到該金屬配合物是否有配位、是幾配位以及具體配位情況。

 

　　FTMS應用實例4)：藥物代謝產物的結構鑒定

　　周博士講到，藥物代謝產物的結構鑒定主要包括三個實驗，一是標樣，接著是control，再與苷立體一起incubation后做單針，比較和苷立體一起代謝看產生了什么新物質。

　　最后，周博士為大家展示了北京大學分析測試中心工作人員的風貌和部分實驗室的先進設備。

　　本網站收錄前沿Lab：北京大學分析測試中心

　　報告下載：北京大學分析測試中心簡介以及Bruker傅里葉變換高分辨率質譜的應用實例

 

　　LC-MS使用心得及離子化方法最新研究進展

　　中國醫學科學院中國協和醫科大學藥物研究所 賀玖明 老師

　　來自中國醫學科學院中國協和醫科大學藥物研究所的賀玖明老師為大家帶來了報告《LC-MS使用心得及離子化方法最新研究進展》。賀玖明老師使用MS已有近十年，經驗非常豐富，他無私地把多年的心得和經驗總結奉獻給大家，對在座的所有質譜使用者都有極大的幫助。

 

　　LC-MS的使用經驗

　　賀老師首先講到：靈敏度是質譜儀的生命，因為高靈敏度是質譜儀的最大優勢，所以使用過程中要保護質譜儀不受污染，需要做到以下幾點：a) 在能獲得很好信噪比的情況下盡可能減少進樣量；b) 進樣遵循先稀后濃的原則；c) 避免使用不揮發性的鹽；d) 嚴禁對ORIFICE直接噴霧(針對AB公司離子源，對其它儀器也有借鑒意義)，噴霧后液體在氣簾檔板上的濺開線外延應離Curtain Plate孔邊3～5mm，流量越大，噴霧針應離Orifice越遠。

　　在LC-MS的使用過程中出現的故障及排除方法，賀老師總結了以下幾點并詳細介紹了自己的經驗：

　　1) 看儀器提示(以AB儀器為例)：屏幕右下角質譜儀狀態變紅

　　2) 電腦與質譜儀不能通訊

　　3) 無信號

　　4) TIC基線不穩定或靈敏度低

　　在判斷是否需要提高檢測器電壓方面，賀老師總結了自己的絕招：比如對于AB的質譜，將檢測器電壓調高100 v左右，如果靈敏度能提高10倍，證明提高檢測器電壓有意義;而如果靈敏度提高很少(比如2倍)，靈敏度的問題就不是由于檢測器電壓過低引起的，調整電壓的意義就不大。

　　5) 背景過高或梯度洗脫不進樣也出峰

　　賀老師還專門總結出一張片子強調，要非常注意維護計算機工作站，因為如果注意的話，儀器會變得運行越來越慢，影響分析。比如：要少裝與儀器無關的軟件，及時備份數據，定期清理臨時文件和進行磁盤碎片整理等。

　　此外，賀老師還分享了自己使用LC-MS過程中的兩條寶貴經驗：1)TOF數據校正失敗后不能打開的挽救方法;2)給出幾種常見加合離子，幫助大家判斷分子離子峰。

 

　　MS^E方法探討——適合于無特定對象的復雜混合物的全分析

　　對目前非常活躍的一個研究領域——藥物的復雜代謝物分析，賀老師還向大家介紹了由Waters提出的MS^E方法——無需選擇母離子進行MS/MS分析的方法，并在非Waters的儀器(AB 公司的QTRAP和 QTOF)上，實現了該方法。這種方法的提出，是由于有時儀器自己判斷的data dependent MS/MS(自動MS/MS，比如AB的IDA模式)功能，并不能保證對真正的、感興趣的母離子進行MS/MS，所以可能會丟失數據。所以，可以在實驗中設置低/高碰撞能切換的數據采集模式，低碰撞能時僅獲得母離子，高碰撞能時獲得該母離子的碎片離子;整個實驗后，再通過數據的比對分析來獲得更多潛在的、全息信息。這種方法適合于無特定對象的復雜混合物的全分析，如對天然產物的母離子和子離子的分析。賀老師采用新建立RRLC-MS^E方法的進行分析，共獲得并發現了58個化合物的質譜數據，推斷其結構主要為槲皮素和山柰酚母核的單糖苷和雙糖苷類成分。

　　MS^E方法原理示意圖

　　賀老師也在復雜混合物分析方面，對MSE與IDA方法進行了比較，并建議：RRLC-MS^E方法對復雜混合物的分析將發揮重要作用，對于完全未知的復雜混合物分析，可以采用RRLC-MS^E方法對其進行快速分析，獲得全面整體的信息，再針對部分疑惑的數據進行RRLC-IDA-MS分析。

 

　　敞開式質譜離子化技術進展

　　敞開式質譜(Ambient Mass Spectrometry)離子化方式以2004年后出現的DESI為代表，目前是學術屆研究的一個熱點，賀老師所在課題組也做了大量的工作。他首先對離子化技術的發展作了簡單回顧。質譜技術是提供物質結構信息的最重要科學儀器之一，離子化技術是質譜儀的關鍵及核心技術，ESI、MALDI的成功研發，極大地推動了生命科學等重要研究領域的發展。離子源經歷從高靈敏度的EI到高靈敏度且可以分析生物大分子的ESI，再到環境開放、敞開結構、無需樣品前處理并可進行表面實時分析的DESI的發展歷程。“敞開式”質譜可應用于生物學/醫學、制藥/食品工業、國家安全/法醫學領域的結構解析和標志物的鑒定。

　　賀老師特別介紹了實時直接分析離子化方法(DART)，并介紹了其它敞開式離子化研究的幾個里程碑。其中包括2007年，由清華大學張新榮教授提出的介質阻擋放電解吸離子化(DBDI)方法。

　　在常壓離子化技術的分類方面，目前可分為電噴霧離子化(ESI)為主要機理的常壓離子化技術和大氣壓化學電離(APCI)為主要機理的常壓離子化技術。

　　賀老師所在課題組目前在研究空氣動力傳輸離子化界面，該方法主要用于氣體泄露的快速檢測，不僅是原位分析，而且可使質譜儀器比較遠離待測物表面，在快速安檢和對易揮發性物質的檢測方面有廣闊的應用前景。

　　報告下載：LC-MS使用心得及離子化方法最新研究進展

　　矩形離子阱核心技術

　　中國計量科學研究院 黃澤建 老師

　　來自中國計量科學研究院的黃澤建老師，為大家帶來了《矩形離子阱核心技術》的報告，對于在座的大部分質譜使用者來說，聽聽質譜儀器研發人員的報告，對儀器尤其是離子阱質譜的工作原理、構造方面的知識有一個了解，是非常新鮮和有趣味的。

　　黃老師的報告分為幾個部分：質譜峰是怎么掃出來的;選擇離子是怎么實現的;MS/MS是怎么做的;線性離子阱有什么優點;以及離子阱與四極桿的區別。

　　在具體談離子阱之前，黃老師先對比了常見的三種小型臺式質譜儀：四極桿、離子阱和飛行時間質譜儀。飛行時間質譜的質量范圍最寬、質量精度和分辨率都很好，不過要想做串聯質譜，不管是四極桿還是飛行時間，都必須串聯第二個分析器。在質量范圍方面，離子阱相比四極桿會有更好表現，目前已有報道用數碼離子阱可以測到140多萬質量數。另外，離子阱的質量分辨率也可以做得很高，比如黃老師所在的課題組就可以做到8000的質量分辨;而最突出的是它的串聯能力，僅靠自身就能實現多級質譜，同時離子阱本身的體積也很小。從技術含量方面來說，四極桿相對成熟，TOF也相對簡單，而離子阱的技術含量最高，也是目前非常活躍的研究領域。

　　在儀器結構方面，通常的質譜都有幾部分構成：離子源、質量分析器、檢測器、配合外圍的電路以及軟件工作站。黃老師特別強調了樣品采集裝置/分離裝置的重要性，因為質譜只是一個檢測器，如果特別復雜的樣品不經過分離直接進入質譜，單靠質譜來識別是非常困難的、需要在軟件上做大量的工作，所以通常質譜前端要接分離裝置。黃老師談到他們在開發儀器時目前遇到的困難，也多來源于樣品采集和前處理這一部分。

 

　　離子阱的基本原理：

　　離子阱的發展歷史：最早是三維離子阱，它模擬了理想的四極場，但其內表面是雙曲面的，加工非常困難。慢慢有人做了簡化，比如柱形離子阱(有商用的儀器)，這還是三維離子阱。后來發展的線性離子阱是在四極桿軸向上加一個直流，比如商用的LTQ。但LTQ這樣的線性阱里面的結構也是雙曲面的，加工也非常困難，要求精度很高。線性離子阱經過簡化后，可以變成矩形離子阱，加工比較簡單，加工成本也不高，我國國內也可以加工。

　　當然，所有離子阱的核心都是從雙曲面的離子阱來的，所以先介紹一下傳統的雙曲面三維離子阱。它由一個環形電極和上下兩個端蓋電極組成，加上前端的離子源入射和檢測器。它的內表面是雙曲面的，加工很困難。

　　離子阱能夠儲存(捕獲)離子，根據馬修方程，當離子在r徑向和z軸向兩個方向都穩定時，離子就能夠被離子阱穩定地捕獲。根據離子穩定圖，當離子在兩個方向都穩定時就被捕獲了，通常利用的是第一穩定區(如圖)。當離子處于穩定位置時，根據馬修方程中a和q的關系式，a和q同離子的質荷比m/z、所加射頻場的頻率、場半徑、射頻電壓、直流電壓有關。商用儀器通常不加直流(即a=0)，離子在一條線上運行，如圖所示，質量數越小，越靠近右側。當掃描射頻電壓時，每個離子的q逐漸由小變大，直到離子脫離穩定區，跑出離子阱，即可被檢測。

 

　　離子阱是怎樣被選擇的、如何作SIM和MS/MS：

　　當然穩定區是假想的狀態，是通過理論模擬的反映離子運動的一種方式，離子在阱里處于各種各樣的狀態。當射頻電壓固定在某一個值時，每個不同m/z的離子在其中有一個振動頻率ω，ω=1/2 βΩ，其中Ω是射頻的頻率，而一臺離子阱儀器的振動頻率是固定的，所以離子的振動頻率僅與β(beta)有關。β和q有個關系式，所以只要知道q的值，就可以知道離子的振動頻率。在穩定圖上可看到q從0到0.908(0.908是其穩定區的邊界)，每一個q值對應的點，都有一個對應的離子振動頻率;也就是說，離子的振動頻率和離子的　m/z沒有關系，而只和q有關系。第10張幻燈片講的是β的q的關系式，有3種估值方法：當q<0.4時，用Dehmelt法估值;當q從0.4到0.7/0.8左右時，用Carrico法估值;還有一種連續估值的辦法。估值的算法比較復雜，第13張幻燈片用列表的方式來計算對應q的β值，所以通過q值就可以知道離子的共振頻率了。

　　簡而言之，當q是一定時掃描射頻電壓，通常是固定一個電壓值，而射頻頻率是固定的，比如對m/z 150的離子，場半徑是固定的、射頻頻率是固定的，當射頻電壓在某一個值時可計算一個q值，比如150在q=0.5這個位置，對應的射頻頻率w假設是200KHz，這時用200 KHz加上去，150在q=0.5這個位置就會共振，當共振幅度足夠大的時候，離子就會振出去了。

　　振動跟振動幅度和時間都有關系，其實大家在商用儀器上都可以調，振動幅度大時時間可以短些，振動幅度小時時間要長些，都可以把離子振出去。注：以前的文獻上談離子的引出檢測時，常介紹離子在達到0.908邊界值時自然從阱內的邊緣場引出檢測;而現在的商用儀器，已經都采用共振逐出離子來檢測，因為這樣的分辨率可以更高。

　　那么怎么做選擇離子呢?因為在電壓固定時，不同的m/z的振動頻率是不一樣的，所以理論上給每一個離子不同的振動頻率，可以選擇性地讓某一個離子跑出去，讓其它的離子留下，這就實現了選擇離子SIM檢測。

　　當在阱中僅保存某個離子時，可把所有其它離子的振動頻率加上，只缺一個該離子的頻率，這樣，其它的離子都被振出去了，只剩下一個離子被保存下來。比如第15張ppt里，就是一個swift的信號，凹槽是這個離子的振動頻率，射頻包括了所有其它離子的共振頻率，僅僅不加該離子的共振頻率，這樣別的離子就都共振逐出阱了，僅留下和貯存了被選擇的離子。

　　選擇完后，這個離子還是有一個振動頻率，這時加一個小一點的振動頻率，就把它打碎了。這時就可以引出MS/MS二級離子檢測。

　　整個離子工作的掃描時序圖如圖所示：

　　首先，射頻給一個恒定的值，這時m/z不同的離子，q值就恒定了。這時候開始離子化，即給一個時間(比如幾百ms)，讓離子跑到阱里，通過門透鏡(gate lense)來控制。當阱內離子達到一定濃度后，就關掉門透鏡，離子即被囚禁，外面的離子進不來。這時用緩沖氣(通常是)氦氣對離子進行冷卻(cooling)，讓其能量降低。冷卻后，加一個swift信號，凹槽就是欲選擇的母離子的振動頻率。選擇后把這個母離子再次cooling一段時間，再加上一個頻率，母離子即被打碎，對碎片離子進行射頻掃描，離子就從小到大地出來被檢測。

　　值得一提的是，離子阱通常說的掃描速度只是后面這一段，而不是整個周期(duty cycle)的。計量院的研發團隊目前掃描速度也可以做到>10,000amu/sec。

 

　　介紹矩形離子阱，及線性離子阱的優點

　　矩形離子阱和雙曲離子阱內部的場是接近的，只不過有一個修正值A2。雙曲離子阱是一個完美的四極場，A2=1;而矩形離子阱做了結構簡化，并不是一個完美的四極場，而疊加了多極場(如四極場、六極場、八極場等)，這時A2就不為1，可能為0.6、0.8等，但這不影響它的分析。因為離子通常在軸心位置，疊加的場都在外圍，而軸心(某個場半徑以內)都近似是一個完美的四極場。

　　相對于三維離子阱，線性離子阱的好處是：離子捕獲(trap)效率更高、質量歧視效應很小。三維離子阱做到600多，是分段做的，如直接從m/z 50~600掃描，質量歧視會很嚴重。

　　如圖所示，三維離子阱很難找到一個電壓來讓每個質量的離子都被很好捕獲，忽高忽低，所以三維離子阱的譜圖和NIST譜庫偏離較大。而線性離子阱的質量歧視很小的，圖示中基本上所有>150amu的離子都能被很好地捕獲。雖然對于<150amu的離子也存在質量歧視，但可以通過一些方法來修正，比如用分段的trap技術來修正質量歧視效應。

　　所以線性離子阱相對三維離子阱是非常有優勢的。從trap容量上來說，線性離子阱比三維離子阱要高很多，前者可以在整個一條軸上穩定離子，而三維離子阱僅能在中心一點上。黃老師也用動畫模擬了離子從進入阱到MS/MS碎片檢測的過程。

　　另外，離子阱體積小，容易做串聯，所以方便實現儀器的小型化。黃老師也談到了其所在課題組將要推出的重量僅10 kg左右的小型離子阱儀器。

 

　　離子阱與四極桿的區別

　　兩者都是利用了四極場，用四極桿時，當離子過去的時候，只有一個符合穩定圖的質量數能夠通過檢測，其它都打在四極桿上不能通過。而離子阱是讓所有離子從小到大都存貯在離子阱中，然后加共振頻率讓離子按照m/z依次從離子阱中引出檢測，因此離子阱對離子可以更多地有效利用。

　　黃老師的精彩報告后，大家饒有興趣地提了很多問題，最后大家參觀了北京大學的分析測試中心。

　　本網站收率前沿Lab：中國計量科學研究院化學計量與分析科學研究所

　　報告下載：矩形離子阱核心技術