ngs檢測是干什么

　　最近常有人問我怎樣才能將NGS的遺傳病檢測開展起來。今天我就根據我們的粗淺經驗寫上幾篇介紹一下心得。分別從前期準備、如何入門、逐步進階、生信深化和自主創新幾個步驟，分別介紹，主要給打算開展NGS檢測服務的臨床機構提供參考。才疏學淺，一家之言，如有不妥，還請海涵。

　　今天是第一篇，準備篇。

　　準備啥呢？一方面準備對照檢測方案，先做起來，積累經驗值，而且也能用來日后做驗證，結果準不準總得有根繩子拽在自己手里才放心；另外，做家屬驗證的時候也需要有個針對性的便宜又準確的方法，總之是不會浪費的。另一方面，就是準備遺傳學的基本知識，結果出來了才發現自己也說不清楚(這是正常的啦，罕見病幾千種呢)，但不知道該怎么去查清楚，那就尷尬了。

　　先來看看NGS能做什么？

　　全基因測序（WGS）、全外顯子測序（WES）在理論上可用于檢測基因突變、拷貝數變異（CNV）、純合狀態（LOH）、單親二體（UPD），延伸開來還可用于易位、倒位等染色體結構異常的判斷。內容太多，就先挑幾個最重要的來準備吧。

　　1、基因突變，NGS的最基本應用。

　　WES可能出錯的地方：探針覆蓋不全、測序深度不足、測序錯誤、重復序列、同源序列等。

　　基本的技術準備：Sanger測序。

　　雖然看起來NGS老牛x了，簡直啥都能干。不過老話說得好，十八般武藝樣樣都通，難免樣樣稀松。WES一次能查出來幾萬個位點，總有一些不那么靠譜的，像測序深度太低或者測序的末端，還有第一外顯子等探針比較少的地方，還有一些是內含子上較遠的位置，在WES里面都是有可能出錯的。所以，WES的結果依然需要Sanger測序來驗證。而且，NGS也不是包打天下的，對于WES探針未覆蓋到的區域，或者重復序列之類的結構特別之處，WES都會歇菜，還需要Sanger測序來補充。所以Sanger測序的作為技術儲備是必不可少的。

　　除此以外，還有Sanger測序的升級版，比如需要Long Range PCR+Sanger測序，用于分析SMA、HLA等同源序列的區域；Sanger測序的精簡版，毛細管電泳，用于亨廷頓、脆X等STR區域檢測等。這些技術也得準備好，要知道患者可不會按著你的檢測目錄來生病，等病人都來了再手忙腳亂地到處找方案容易忙中出錯。

　　必要的知識儲備：遺傳學知識和文獻檢索技能。

　　常見病大家都熟，便宜、快速又準確的檢測方法也很多。所以能攤上NGS的，都是少見或者罕見的疾病。可是少見病和罕見病見得少啊，都不熟，這個時候，充分的知識儲備、完善的文獻檢索技能、還有謹慎的態度，就很重要了。

　　拿地貧來舉例吧，不是所有的a地貧突變、β地貧突變都是導致地貧的，a有缺失、有突變、有涉及單個基因、兩個基因、β有β0還有β+，嚴重程度各不相同，并不是所有的突變都會致病、而且也不是所有的致病性的位點湊到一起都會導致重型地貧。即使數據庫里面確認是致病性的，有些突變可能只是導致異常血紅蛋白病、鐮形細胞貧血等疾病。并不是所有hba、hbb的致病突變就一定是致“地中海貧血”這個病的。在實際工作中，搞不清楚地貧和hba、hbb突變的關系而鬧笑話的情況也見得不少了，一不小心就會把不重要的血紅蛋白病突變定義為地貧致病位點，把人嚇個半死，一定要小心，多學習，多咨詢，下結論一定要謹慎。（可以翻翻之前的文章，之前燕燕講遺傳中提到過相關案例）

　　地貧在華南地區比較常見，是個很好的學習模板。對于非華南地區的同行來說，以耳聾作為學習的模板也是非常合適的。

　　現在國內很多地區都開展了耳聾基因的突變篩查，9位點篩查的攜帶率一般在5%以上，發病率也不低，還是比較容易找到學習對象的。常用的GJB2、GJB3、PDS、mtDNA的常見突變組合包含了顯性遺傳、隱性遺傳、線粒體遺傳不同的模式，看上一圈各種不同遺傳模式的特點就全有了。此外，GJB2某些位點還涉及皮膚病的基因多效性現象、或者涉及不完全外顯的遺傳模式、甚至還有與其他基因共同作用，體現雙基因遺傳的突變位點。GJB3、PDS的延遲顯性，PDS的劇烈運動以后的誘發表現，PDS的P為主、D為主或者P+D都出現的臨床表現模式都是臨床遺傳過程中常常出現，但傳統教科書上較少強調的現象。把耳聾仔細整理上一輪，日后見到其他遺傳病以及基因突變的時候，就能做到心中有大局觀，不會隨意給基因和突變下結論了。遺傳機制豐富多樣、醫學科學還在不斷完善，既往的結論不見得就是全面的結論，碰到一個新的疾病，一定要縱覽OMIM、GeneReview、Clingen、Clinvar各種數據庫、文獻以后再酌情下結論才比較安心。

　　2、大片段拷貝數變異（CNV）及LOH、UPD，采用CNV-SEQ和WES-CNV分析，很火的概念，大有取代CMA之勢。

　　染色體是按條來遺傳的，父母染色體結構異常是很多胎兒染色體CNV異常的基礎。換句話說，就算用NGS查到了CNV，也得能憑空反推可能的發生機制，下次的再發概率，后代的遺傳風險概率等一系列病人最關心的問題才行。這個時候，臨床醫生非常需要細胞遺傳學的知識儲備。

　　即使現在被視為金標準的CMA技術，在開始的若干年內，也是需要采用FISH技術作為驗證的。而且在臨床上直到現在，依然有很多CNV需要去判斷結構、來源、位置，也是需要FISH技術來確認。FISH與核型分析作為常規觀察染色體結構的技術，必不可少。所以在開展NGS之前，臨床實驗室還得有細胞遺傳學檢測技術的儲備。

　　搞清楚CNV的結構來源有多重要呢？光講理論我頭疼，搞些題目來大家一起頭疼吧！

　　a、一個患兒發現染色體上一段大片段缺失、一段大片段重復，中間夾著一段正常，與缺失直接連著重復的患兒相比，其父母下胎生育染色體異常患兒的比例會有什么差別？

　　b、對于染色體一個中間大片段重復的患兒，與一個染色體末端大片段重復的患兒，發生機制上有什么不同，遺傳檢測上需要注意什么？

　　c、發生在染色體末端的LOH與發生在中間的LOH，后續的檢查與預后判斷上，有什么不同？

　　d、一個發生平衡易位的患者，其配子會有多少種核型？

　　以上問題主要是從染色體的結構與正常遺傳規律和變異發生機制的角度來分析。對于從染色體核型分析做到FISH、再做到CMA的機構來說應該早就被蹂躪過千百次，見怪不怪，云淡風輕了。如果還沒有被蹂躪過的，為了盡快接招，趕緊準備起來吧。

　　3、小片段CNV

　　片段越大NGS檢測CNV的準確率越高，但是小片段依然可能就是致病原因，當z值較高（可能性較大）的時候，就需要去驗證了。方法很多，用MLPA、QF PCR、Real time PCR等，選習慣的方法就行。

　　準備篇就講到這里，做好了細胞遺傳學和分子遺傳學的技術準備，以及醫學遺傳學的知識儲備之后，下次我們來講講怎么選平臺、怎么選方案、怎么選檢測目標、還有選什么樣的大粗腿來合作的問題。