pH值、溫度、抑制劑對蔗糖酶活性的影響——二硝基水楊酸法

蔗糖

磷酸氫二鈉 磷酸二氫鈉 檸檬酸 乙酸鈉 脲 乙酸緩沖液 葡萄糖 二硝基水楊酸

分光光度計 水浴鍋 試管 保鮮膜

【實驗方法】
 
自行設計。
 
【方案舉例】
 
實驗方法 1:
 
1. 按下表配制12 種緩沖溶液(公用)。
 
將兩種緩沖試劑混合后總體積均為10 ml，其溶液pH 值以酸度計測量值為準。
 
2. 準備二組各12 支試管， 第一組12 支試管每支都加入0.2 ml下表中相應的緩沖液， 然后加入一定量的蔗糖酶（此時的蔗糖酶只能用H₂O 稀釋， 酶的稀釋倍數和加入量要選擇適當，以便在當時的實驗條件下能得到0.6～1.0 的光吸收值（A₆₅₀） ）。另一組12 支試管也是每支都加入0.2 ml下表中相應的緩沖液，但不再加酶而加入等量的去離子水，分別作為測定時的空白對照管。所有的試管都用水補足到0.8 ml。
 
3.  所有的試管按一定時間間隔加入0.2 ml 蔗糖（0.2 mol/L）開始反應， 反應5 min后分別加入1.0 ml 0.2 mol/L NaOH 終止反應， 接著加入1 ml 二硝基水楊酸試劑， 用保鮮膜包住試管口并刺一小孔，在沸水浴中煮5  min，取出速冷，然后加入5.0 ml 水，搖勻測定A520。
 
4. 本實驗再準備二支試管， 一支用水作空白對照; 另一支作葡萄糖標準管。
 
5. 畫出不同pH 下蔗糖酶活性（μmol/ min）與pH 的關系曲線，注意畫出pH 值相同， 而離子不同的兩點， 觀察不同離子對酶活性的影響。

實驗方法2:
 
本實驗要測定0～100 ℃之間不同溫度下蔗糖酶催化和酸催化的反應速度。包括冰水浴的0 ℃、室溫(約20 ℃)、沸水浴的100 ℃和不同的水浴溫度:10 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃。
 
每個溫度準備2支試管，一支加酶，測酶催化，1支不加，以乙酸緩沖液作為酸，測酸催化。

1. 確定酶的稀釋倍數，試管中加入0.2 ml 0.2 mol/L，pH 4.9的乙酸緩沖液，0.2 ml稀釋的酶，加水至0.8 ml，加入0.2 ml 0.2 mol/L的蔗糖開始計時，在室溫下反應5 min分別加 入1.0 ml 0.2 mol/LNaOH 終止反應，接著加入1 ml二硝基水楊酸試劑，用保鮮膜包住試管口并刺一小孔，在沸水浴中煮5 min，取出速冷，然后加入5.0 ml水，搖勻測定A₅₂₀。 

2. 測定上列各個溫度下的反應速度，每次用2支試管，均加入0.2 ml乙酸緩沖液，一支加0.2 ml酶，另一支不加酶，均用水調至0.8  ml，放入水浴溫度下使反應物平衡30 s，加入0.2 mol/L蔗糖0.2 ml，準確反應10 min，立即加入1.0 ml 0.2 mol/LNaOH終止反應，按規定進行操作，測定各管A₅₂₀值，記錄每個水浴的準確溫度。 

3.酶催化的各管A₅₂₀值均進行酸催化的校正。分別畫出酶催化和酸催化的反應速度對溫度的關系曲線和lnk-1/T的關系曲線，用二條lnk-1/T關系曲線的線性部分計算兩種活化能。


實驗方法 3 :
 
1. 判斷可逆與不可逆抑制的實驗可選做。 

2. 不含抑制劑(脲)的實驗，可用實驗(七)的數據，但必須用同一稀釋倍數的酶，也可以重做，注意酶濃度要大些。

 
 3. 含脲抑制劑的實驗可參照表2設計實驗方案。共做三種抑制劑濃度[I]的實驗，即分別為加4 mol/L的脲0.10 ml、0.20 ml和0.30 ml（注意:此時要分別少加H₂O 0.1 ml、0.2 ml和0.3 ml），仍為12支試管，每支試管都要加脲，第9、第10兩管仍為校正酸水解。第11、第12標準管也要加脲，以消除脲對顯色的影響。 

4. 畫出反應速度與底物濃度的關系圖，和I/V-I/[S]關系圖，計算Km、Vmax、KI和相應的表觀值，討論脲對蔗糖酶活性的影響。