親和層析實驗：常規方法（二）

二、配基的選擇

選擇合適的配基，需要對配基和靶分子之間的天然相互作用有一定的認知及理解。

靶分子與配基的相互作用必須是特異性結合，并且在不同的結合和洗脫條件下均應該穩定。此外，制訂親和純化的方案時，需著重考慮能否購買到商品化配基，還是需要從頭研制配基和介質。后者的成功在很大程度上取決于對蛋白質結構和相互作用特性的已有認識，需要采用分子模建、化學合成和有機偶聯聯合以及對選擇性結合的分析。事實證明，設計一個新型配基、開發合適的偶聯化學作用和介質的時間和精力過于冗長和昂貴，因此這種情況下使用非親和純化技術可能是一個更好的選擇，如離子交換和疏水相互作用。

1.設計和選擇配基的一般注意事項

在開發一個新的親和純化材料時, 配基和靶分子之間的親和力是最重要的注意事項。

低親和力會降低結合效率, 導致回收率下降。親和力過高，苛刻的洗脫條件會導致目標蛋白質洗脫效率低或使其滅活，進而降低回收率。一般來說，親和常量為 IO6~IO8mol-1 時, 可用于親和純化。與目標蛋白質結合的親和配基，在與親和介質連接前最好先進行評估。要注意的是固定后配基的親和力可能與在溶液中的親和力不同，某些情況下，甚至可能改變特異性。

共價偶聯是將配基吸附于介質的首選方法，可以降低在純化過程中濾去配基的風險。

然而，在沒有活性基團存在的情況下也可以使用非共價吸附策略，或是用于降低配基變性的風險，如非特異性吸附、生物特異性的相互作用(生物素-鏈霉素）、包封(entrapment)及最近開發的分子印跡(Alexanderetal.,2006)。詳情請參閱本章第4節。

配基與靶標之間結合能力的降低，除親和力弱這一因素外，也可能是因為基質或其他配基導致的空間位阻引起的。配基和介質之間間隔物的介入能夠降低介質造成的空間位阻(Hageetal.，2006)。設計間隔臂(spacerarm)時，應該考慮其長度和疏水性兩方面，因為可以通過增強親水性而減少配基與靶標外其他分子的非特異性相互作用。間隔長度的優化也很重要，間隔太短也許不能緩解介質的空間位阻效應，間隔太長則可能會促進非特異性的相互作用, 或者可能會形成自身折疊從而限制特異性的相互作用。表面的配基密度也要進行優化。非常高的配基密度可能產生反作用, 造成結合能力喪失，原因可能是結合位點靠的太近形成空間位阻，或是強結合力限制洗脫效率(Hageetal」2006)o其他因素也可能影響最佳配基的選擇，如能否消毒、配基的穩定性、適當的儲存條件和價格等。

2.固定化配基的特征

親和樹脂是否具備在重復應用中保持性能相似的能力是判斷其實用性的—個重要因素。因此，確定最佳反應條件以保證性能一致顯得十分重要，包括優化合成所需的配基數量。確定合成中所需最佳配基量可以防止配基過多造成浪費, 進而降低成本。

對于共價連接，一般需要分析介質可連接的配基數量，并確定偶聯條件如何影響固定配基的數量。確定配基密度的一個簡單方法, 是分析反應后剩余的配基數量。偶聯完成后，用初始的配基總量減去剩余的配基數量。根據配基的性質，應采用不同的檢測方法，如分光光度法、BCA法(檢測蛋白質)、Ellman，s埃爾曼試劑（檢測巰基）、熒光檢測或其他檢測方法（Guilbault,1988;Langone,1982)。

某些情況下，如通過氨基酸分析或元素分析, 可以直接檢測載體上的配基，但是這會破壞材料，因此只適合少量檢測。結合能力評估可以間接評價固定化配基, 使親和介質處于純化所需條件下，評估保留在介質上的靶分子數量。這種方法與親和介質的性能直接相關，因此可能是固定化配基最有意義的檢測形式。最大載量需在平衡狀態下評價，通常以緩慢的流速或以直接混合的結合模式進行。注意：由于動態結合受到流速、介質孔隙內質量轉移以及親和常量的影響，因此動態結合能力可能與最佳結合能力不同。

3.運載特定配基的親和介質

近年來，我們見證了針對不同靶分子的親和配基以及商品化特異性介質的迅猛發展。

常用商品化配基的概述見表 26.2, 但并未涵蓋所有可購買的配基。現有大多數可購買的親和介質連接的配基通常稱為「組特異性配基」(groupspecificligand), 表現為對一組結構或功能相似的蛋白質形成親和連接，可以用于純化具有類似功能的不同目標蛋白質。在下面的章節中，我們描述一些親和介質常用配基。

4.免疫球蛋白結合蛋白質

免疫球蛋白的恒定區(Fe)與ProteinA 或 ProteinG之間可以結合，以此為基礎的抗體純化是親和純化中最有效并且常用的方法之一。ProteinA來源于金黃色葡萄球菌，ProteinG來源于鏈球菌。兩者均為細菌相關蛋白，可以與IgG類抗體結合—-這些抗體可以為不同亞型, 也可以來源于不同有機體。目前有很多關于 ProteinA和ProteinG親和力差異的詳細說明，如供應商提供的商品化產品說明（Gussetal.，1986;Hageetal.，2006)。此外，最近ProteinB和ProteinL 作為免疫球蛋白結合蛋白應用廣泛。proteinB是一類A鏈球菌的表面蛋白，可以結合某些人IgA型抗體，ProteinL[馬格努斯消化鏈球菌(Pe辦OSZr印tococcwsmagmfs)]能夠與kappa輕鏈相互作用, 且不影響抗體的抗原結合位點（Faulmannetal.，1991;Hermanson，1992)。因此ProteinL成為唯一的適合純化缺乏Fc區抗體的蛋白質。

大多數情況下，在中性或接近中性 pH 的條件下抗體結合能力較好, 但不同樣品的最適pH并不相同，這取決于具體使用的蛋白質。ProteinA在pH8.2時結合抗體的能力最強，ProteinL為pH5,ProteinG為pH7.5，但ProteinG也可以在pH7~7_5時使用。樣品洗脫常為酸性 pH(2.5~3.0)環境, 為避免樣品在低pH洗脫過程中變性或喪失生物活性，將其收集在中性或弱堿性緩沖液中。為防止低pH洗脫造成生物穩定性喪失, 需要探索鹽梯度與pH梯度結合的洗脫方式。

5.凝集素

凝集素是一組多樣化蛋白質，可以結合碳水化合物，具有高度的特異性。每一種凝集素都具有自己特異的使用方案。常用于從復雜的糖復合物中親和純化或濃縮碳水化合物基團，如多糖、糖脂和糖蛋白。還可以根據糖基化的特點，特異性分離不同的糖結構模式 (glycolform)。現在，凝集素不僅應用于純化含糖分子，也可以用于質譜分析時濃縮糖蛋白亞類(Hirabayashi，2008)。詳見第34章。

目前有超過1 00種的商品化凝集素，包括結合形式和單體形式，其中大部分是植物來源。來源于直生刀豆(CanawZiaensi/onm’s)的凝集素，即刀豆球蛋白A(ConA)是最常用的凝集素(Hermanson，1992), 其可以與『1>甘露糖、萄糖和JV-乙酰葡糖胺親和結合。另外兩個廣泛使用的凝集素是麥胚凝集素(WGA) 和榴蓮凝素(jacalin)。WGA 結合唾液酸和含有的N-乙酰-1>氨基葡萄糖殘基的分子, 榴蓮凝素結合 D-半乳糖基團。

通常在中性 pH、含糖條件下，將凝集素偶聯到樹脂上，這可以保護糖結合位點。靶分子通常也需要在中性 pH 條件下與凝集素結合。需要注意的是，有些凝集素需要二價金屬離子的存在，這樣更有利于靶分子結合，如 ConA 結合需要 Ca2+和 Mn2+。在洗脫緩沖液中加入過量的特異性糖分子進行洗脫，也可以進行梯度或分段洗脫。洗脫后，可通過透析或分子排阻的方法除去游離糖。