realtimePCR體系的優化

實時定量PCR以其精確、快速、方便，越來越多的應用在科研、臨床及檢驗檢疫的各個領域。但是定量PCR是對精確性要求很高的實驗，實驗的條件對實驗結果的影響非常大。在此談談體系優化的問題，希望對做相關試驗研究的朋友有所幫助。

1、基本參數的優化：

1）MgCl2的濃度：在PCR反應中，MgCl2的濃度對酶的活性是至關重要的，不僅如此，合適的MgCl2的濃度還能在反應中得到較低的 Cp(crossingpoint)值（指PCR達到指數擴增期時，產生一定的熒光高于背景并為儀器所識別時的循環數），較高的熒光信號強度以及良好的曲線峰值。所以對其的濃度選擇應慎重。一般來說，對以DNA或cDNA為模板的PCR反應，應選擇2－5mM濃度的MgCl2，對以mRNA為模板的 RT－PCR而言，則應選擇的濃度為4－8mM。

2）模板的濃度：如果研究者是進行首次實驗，那么應選擇一系列稀釋濃度的模板來進行實驗，以選擇出最為合適的模板濃度，如果條件困難，也至少要選擇兩個稀釋度（高和中、低濃度）來進行實驗。一般而言，使Cp位于15－30個循環比較合適，若大于30則應使用較高的模板濃度，如果Cp小于15則應選擇較低的模板深度。對于Cp值的確定，經驗上是SYBRGreenI探針的熒光信號比本底高2倍，雜交探針的熒光強度比本底高0.3倍。

2、使用SYBRGreenI測定DNA時的條件優化：

1）MgCl2的濃度：大多數引物－模板對其的要求是2－4mM。

2）模板的濃度：初次實驗要求做一系列的稀釋濃度，如條件限制，至少完成兩個稀釋的度的測定。DNA在50ng-5pg之間選擇，質粒DNA在 106拷貝數左右。

3）引物的濃度：引物的濃度是一個影響PCR反應的關鍵因素，若濃度太低，會致使反應不完全，若引物太多，則發生錯配以及產生非特異的產物的可能性會大大增加。對于大多數PCR反應，0.3uM是個合適的濃度，若初次選用這個濃度不理想，可在0.1－1.0uM之間進行選擇，直至達到滿意的結果。

4）退火溫度：首次實驗設置的退火溫度應比計算得出的Tm值小5℃，然后在1－2℃內進行選擇。一般的，退火溫度要根據經驗來確定，這個經驗值往往會同計算得到的Tm值有一定的差距。

3、用SYBRGreenI進行一步法RT－PCR的條件優化：

1）MgCl2的濃度：不同的靶分子選用不同的濃度，通常是在4－8mM之間選擇。

2）模板的濃度：RT－PCR實驗既可以選用總RNA，又可以選用mRNA，其濃度應在1pg-1ug之間選擇。對于低模板濃度，可以增加適量的 MS2或用alternativeRNA作為載體進行測定。

3）對照設置：每一引物都應設有陰性對照，陽性對照和污染對照。

4、雜交探針測定DNA

1）MgCl2的濃度：在2－4mM的基礎上加0.5－1.0mM，但是不要超過2.0mM。

2）雜交探針的濃度：初次實驗每個探針用0.2uM，如果信號強度達不到要求，可以增加至0.4uM。

3）對照設置：每一引物都要設陰性對照，每一探針都要設陰性對照。每次實驗都要設陽性對照。

4）其它的條件同SYBRGreenI。

5、用雜交探針進行實時定量RT－PCR：

1）MgCl2的濃度：在4－8mM之間進行選擇。

2）雜交探針的濃度：初實驗用0.2uM，如果熒光信號強度不足，可以增加至0.4uM。

3）模板濃度設置：優化的擴增須進行一系列稀釋度的實驗，在條件有困難的情況下，至少要進行兩個稀釋度的測定。選用1pg-1ug的總RNA或是 mRNA，若是模板的濃度過小（小于10ng/ul），則可加入MS2或alternativeRNA作為載體。

4）對照設置：每個引物都要設無模板對照，陽性對照以及污染對照。

6、關于雜交探針的評價：

在使用雜交探針進行實驗時，必須注意防止探針－引物二聚體的形成和其本身在反應過程中的延伸。引物－探針二聚體的形成，主要是因為探針可與引物的 3’末端雜交，其形成以后，會致使此二聚體擴增，從而同目的基因競爭反應的原料，導致反應的效率下降。探針其本身能同目的基因相結合，且其解鏈溫度高于引物，所以它可能作為引物而引發延伸反應，為了防止發生這種現象，通常是將其3’末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是沒有磷酸化，就會產生目的基因的副產品，從而干擾實驗結果。鑒于以上這兩點，所以應對探針精心設計，并將其末端完全磷酸化。