staurosporine誘導的細胞凋亡

妊娠的C57BL 6cr小鼠

staurosporine 蒸餾水 脫氫酶 ZVAD-fmk LDH試劑盒 Caspase3試劑盒 膠原酶Ⅱ 醌 氯化鋇 細胞計數試劑盒 STS TrypsinEDTA DIDS NPPB

顯微鏡 試管 離心管 移液槍 離心管盒 冰盒 冰箱 培養箱 離心機 載玻片 蓋玻片

一、原代心肌細胞的培養及實驗方案

1. 取出生后0~24 h C57BL/6cr小鼠心臟，按改良的Lader方法進行細胞的分離。 獲取博動的心臟迅速放置于無Ca²⁺、Mg²⁺的Hank’s平衡液中。

2. 剪碎心臟，放置在4℃條件下100 g/L的Trypsin溶液中消化16~18 h，用Trypsin抑制劑中止消化。

3. 然后在37℃下，用膠原酶Ⅱ于CO2培養箱內，在搖床上繼續孵化消化45~60 min。

4. 最后用70 μm直徑尼龍過濾網過濾獲取心肌細胞，用含有25 mmol/LHCO3^-，100 mL/L FSB，1×10⁵ u/L青霉素G和50 g/L鏈霉素的M199培養基制成細胞懸液，按差速貼壁分離法純化心肌細胞。

5. 加入10 μmol/L BrdU到細胞懸液，以6×10⁵密度種植于96或24孔細胞培養板上，置37℃培養箱培養。

6. 培養的心肌細胞24 h后更換含有10 μmol/L BrdU新鮮M199培養基，培養72 h后進行實驗使用。

7. 設立陰性、陽性對照及實驗組，每組20孔；陽性對照加入4 μmol/L STS，實驗組中加入4 μmol/L STS后再分別加入250 μmol/L DIDS或100 μmol/L NPPB，100 μmol/L Quinine和1 mmol/L BaCl2孵化4 h，更換新鮮M199培養基繼續孵化4 h后進行各種指標的檢測。

二、細胞存活試驗

1. 按照實驗方案處理后的培養心肌細胞，每100 μL培養基的小孔中加入10 μL的MTT再孵化2 h，用分光比色儀進行檢測，實驗結果以細胞存活率表示，細胞存活率=A試驗組/A對照組×100%。MTT法A值既能反映心肌細胞內線粒體脫氫酶活性，又能間接反映心肌細胞的增殖與存活情況。

三、凋亡瓊脂糖凝膠電泳檢測

1. 收集24孔板處理過的細胞，棄上清加入50 μL含有200 mg/L的RNase細胞裂解液(10 μmol/L Tris·HCl，0.1 mol/L EDTA，5 g/L SDS)，37℃孵化1 h再加入500 mg/L蛋白酶K繼續孵化。

2. 1 h后加入等體積的酚、氯仿、異丙醇（25∶24∶1）充分搖勻，離心取上清再加入等體積的氯仿抽提1次，轉移的上清液中再加1/10體積3 mol/L醋酸鈉及兩倍體積的無水乙醇過夜后離心，700 mL/L的乙醇洗滌后，TE液溶解DNA，于20 g/L含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外透射儀下觀察、記錄拍照。

三、Caspase3活性的檢測

使用ApoONETM Homogeneous Caspase3試劑盒檢測Caspase3活性。實驗設立空白、陰性對照及實驗組，含有100 μL培養基的實驗細胞中，加入100 μL的混合Caspase3底物ZDEVDR110和緩沖液，在室溫下輕微搖動孵化6~8 h，用熒光檢測儀于激發波為485 nm，散發波長538 nm處，讀取檢測熒光值.

四、心肌細胞膜完整性檢測

細胞培養上清乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測，LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2，4二硝基苯肼反應生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色，通過比色可求出酶活力。取細胞培養上清50 μL，反應后490 nm處測A值。

1. 嚴格進行消毒．使用三套器械取材。

2. 嚴格進行無菌操作，防止細菌、真菌、支原體污染，避免化學物質污染。

3. 吸取液體前，瓶口和吸管進行火焰消毒；經火焰消毒后的吸管一定要用Hank’S液冷卻。防止燙傷、燙死細胞。吸取液體時，避免瓶口和吸管接觸碰撞。

4. 離心管入臺前，管口、管壁應消毒。