1.5 熒光與光學顯微鏡
在PEI包被 IbiTreat μ-Slide 8-孔反應板（德國Munich，Ibidi） 上培養皮質神經元細胞，培養 6 天。然后，將培養細胞固定于 +4°C 磷酸緩沖液（PBS）（pH 7.4） 多聚甲醛中。使用 0.2% Triton X-100/PBS 對神經元細胞進行透化處理，使用 10% （v/v） 標準山羊血清（NGS）與2% （v/v） 牛血清白蛋白 （BSA）PBS，于室溫處理 1 小時進行終止。+4°C 環境下，將神經元細胞與神經元標志微管相關蛋白2 (microtubule-associated protein 2，MAP-2） （英國劍橋Abcam, ab11267, HM-2, 1:600 稀釋）小鼠單克隆抗體共同孵育，孵育過夜。第2 天，將細胞與山羊抗小鼠二抗（Alexa Fluor? 488 goat anti-mouse IgG （H+L） (Invitrogen, 1:250 稀釋）共同孵育。使用DMI6000 B 倒置顯微鏡（德國，Leica ）收集熒光成像信息，LAS AF 軟件（德國Mannheim，Leica Microsystems 公司Leica Application Suite, Advanced Fluorescence 2.2.0）分析。使用配備有 Lumenera Infinity 2 數字攝象機（加拿大 Ottawa，Lumenera 公司）的Axiovert 200 顯微鏡（德國 Jena ，Carl Zeiss ）獲取光學顯微鏡的成像信息。10x 2.5 NA 物鏡 （德國 Jena ，Carl Zeiss）采光，通過相差進行成像捕獲。INFINITY ANALYZE 軟件 （Lumenera 公司） 數字成像記錄與成像分析。
3 結果
3.1 神經元 HT-22 細胞增殖
為對神經細胞系 HT-22 的生長與增殖情況進行評價，將細胞以不同密度（4500、8000
與 20000 細胞每孔） 接種于 E-Plate 96 上，并使用xCELLigence RTCA MP 儀器進行監測，監測 48 小時。首先細胞粘附于培養孔表面后，阻抗會顯著增加，后期實驗中，HT-22 細胞增長穩定。最終的各生長曲線，斜率非常相似，僅各培養孔絕對 CI 值不同，CI 值隨各自接種密度的（參見圖 1A 與 B）不同而不同。
圖 1：E-Plate 96 中的 HT-22 細胞濃度梯度，及谷氨酸毒性檢測。
（A） 將指定細胞密度的 HT-22 細胞接種于 E-Plate 96 上，并使用 xCELLigence 系統進行 48 小時記錄。接種后 24 小時，使用谷氨酸對細胞進行處理。（B） HT-22 細胞指數 （CI） 值，在谷氨酸添加時間點進行標準化。（C） 持續性xCELLigence 細胞監測后，于 E-Plate 96 中進行 MTT 終點實驗，對細胞活性進行檢測。
為進行 HT-22細胞死亡誘導，使用不同劑量的谷氨酸（3 與 5 mM）。這些細胞中，谷氨酸可導致谷氨酰胺的消耗，從而促進活性氧的生成，導致線粒體損傷與細胞死亡[2, 3]。谷氨酸處理后 8-10 小時期間，未檢測到 CI 值改變。其后 4-6 小時期間，CI 值快速降低。阻抗曲線圖反映出劑量依賴性的谷氨酸誘導的細胞死亡。阻抗測定后的E-Plate 96 反應板 MTT 實驗結果進一步證實了本研究結果（參見圖1C）。不同細胞接種密度與不同谷氨酸濃度下，細胞死亡的開始時間略有不同。如圖 1B，xCELLigence記錄阻抗圖在藥物給定時間點，對CI 值進行標準化。xCELLigence系統檢測到的谷氨酸誘導的細胞死亡動態變化，同前期研究中谷氨酸誘導HT-22 細胞死亡的時間段及特征具有良好的重復性，包括線粒體斷裂與細胞核 AIF 轉位[2, 3, 4]。
3.2 CELLigence系統神經保護作用檢測
為測定xCELLigence 系統是否可檢測神經保護作用，我們使用預凋亡BH-3 蛋白BID的小分子抑制劑，即 BI-6C9，來防止谷氨酸對 HT-22 細胞的毒性作用。如圖 2A 所示，在HT-22細胞預先添加 3 mM或5 mM的谷氨酸的情況下，BI-6C9可有效防止谷氨酸誘導的 HT-22 細胞的凋亡。儀器記錄的 BI-6C9 處理的細胞，無論是否添加谷氨酸，其CI 值均持續增加，表明BI-6C9 可維持細胞形態并延長細胞生存時間。而且使用實驗終止后的E-Plate 96 孔板，及在實驗時平行設置的附加標準 96 孔板，進行細胞增殖（MTT）實驗 ，均驗證了BI-6C9-介導的保護作用（參見圖 2B）。這些結果進一步證實了xCELLigence系統
可用于監測細胞活性。通過光學顯微鏡觀察，將藥物對 HT-22 細胞形態學的作用進行記錄（參見圖 2C）。添加谷氨酸后，細胞發生顯著形態學改變，細胞固縮并從培養板脫落，阻抗降低。通過 xCELLigence 系統相應 CI 值監測記錄，進一步證實了這種情況，監測記錄表明，谷氨酸處理后，CI 值降低。然而在添加 BI-6C9 后，HT-22 細胞形態未改變，CI 值記錄進一步證實了神經保護的作用（參見圖 2A）。
圖 2：細胞阻抗檢測HT-22 細胞神經保護作用。
（A）xCELLigence 系統對檢測Bid 抑制劑 BI-6C9 的神經保護作用。接種后，使用 BI-6C9 與/或谷氨酸對 HT-22 細胞進行處理，記錄 24 小時細胞指數（CI）值。（B）通過 MTT ，對細胞活性進行檢測，左側列數據為E-Plate 96終止CI 后進行的檢測，右側列數據為標準 96 孔細胞培養板中進行的檢測。（C）通過光學顯微鏡觀察，記錄藥物對 HT-22 細胞形態學的作用。