CRISPR新成果：針對長鏈非編碼RNA的完全敲除高通量篩選

　　之前的方法在效率、質量（假陽性、假陰性）上各有欠缺：比如CRISPRi的方法只能實現基因表達抑制而不是完全敲除，CRISPRa的方法只能上調基因表達，無法對基因不可或缺的作用實施篩選評估。大片段刪除的策略由于步驟的繁瑣，也限制了其在更大規模上得到應用。

　　作為強大的基因編輯工具，CRISPR/Cas9系統能夠在蛋白編碼基因的外顯子區域產生移碼突變而徹底破壞蛋白表達及功能，這一特性被廣泛應用于基因的大規模功能性篩選研究。人類基因組中除了蛋白編碼基因，絕大多數區域為非編碼序列。其中長鏈非編碼RNA（lncRNA）已有上萬個位點被注釋，但是它們絕大多數功能未知，一些已知功能的lncRNA與癌癥等很多疾病的發生發展密切相關。

　　來自北京大學生命科學學院的研究人員發表了題為“Genome-wide screening for functional long noncoding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites”的論文，構建了特異性靶向基因的剪接位點的新型CRISPR文庫，以高通量的方式產生基因的外顯子缺失或者內含子滯留。首次真正實現了從全基因組水平對長鏈非編碼RNA進行基于完全敲除的高通量篩選，該方法學將為系統發現和解析lncRNA功能提供有效的工具。

　　這一研究成果公布在11月5日Nature Biotechnology雜志上，由北京大學生命科學學院魏文勝教授領導完成，文章第一作者為劉瑩、曹中正、王軼楠以及郭昱。

　　之前，魏文勝課題組與合作者之前率先建立了通過成對gRNA（pgRNA）在基因組中產生大片段刪除的策略來對lncRNA進行高通量功能性篩選（Zhu et al. Nature Biotechnol 2016）。后續又有報道通過CRISPRi（Liu et al. Science 2017）以及CRISPRa（Joung et al. Nature 2017）等方法來進行lncRNA的高通量功能性篩選。

　　但這些方法在效率、質量（假陽性、假陰性）上各有欠缺：比如CRISPRi的方法只能實現基因表達抑制而不是完全敲除，CRISPRa的方法只能上調基因表達，無法對基因不可或缺的作用實施篩選評估。大片段刪除的策略由于步驟的繁瑣，也限制了其在更大規模上得到應用。

　　為了突破以上方法上的局限，魏文勝研究組設計了新的篩選策略，構建了特異性靶向基因的剪接位點的新型CRISPR文庫，以高通量的方式產生基因的外顯子缺失或者內含子滯留。運用這一策略，實現了全基因組水平上對于lncRNA功能的高效篩選。

　　研究人員利用靶向10,996個 lncRNA的特殊CRISPR文庫，在慢性髓性白血病細胞K562中篩選并發現了230個 lncRNA與細胞存活或增殖相關。在HeLa細胞以及人B淋巴細胞GM12878中則分別發現了115個及220個影響細胞存活與增殖的lncRNA。進一步分析表明，lncRNA功能在不同細胞種類中具有顯著異質性。

　　這一新型高通量技術平臺的建立，首次真正實現了從全基因組水平對長鏈非編碼RNA進行基于完全敲除的高通量篩選，該方法學將為系統發現和解析lncRNA功能提供有效的工具。

(a) 真核生物（人）剪接位點區域的基因組序列特征和堿基特異性。(b) 靶向剪接位點的長非編碼RNA的功能性篩選策略。(c) K562細胞中影響細胞存活與增殖的lncRNA篩選結果。