原代細胞純化方法

　　（1）胰蛋白酶 純化法

　　●在去除不需要的組織后，使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片，通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復清洗2到3次。

　　●將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100 mg組織加入1ml 胰蛋白酶）。

　　●在4℃孵育6到18小時，使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進去。

　　●移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。

　　●在組織碎片加入熱的完全培養基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。

　　●通過無菌不銹鋼絲網（100～200 mm）過濾，分散所有剩余組織。計數和接種細胞，進行培養。

　　（2）膠原酶純化法

　　●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次。

　　●加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）。

　　●在37℃孵育4到18小時。加入3mM CaCl2增加解離效率。

　　●通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。

　　●通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。

　　●再一次在培養基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進行培養。

　　（3）Dispase純化法

　　●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。

　　●加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液）

　　●在37℃孵育20分鐘到幾個小時。

　　●通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液，以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。

　　●通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。

　　2. 分離細胞后，第一次傳代需要注意的問題：

　　●傳代培養時先觀察細胞的活性。

　　●細胞的活率應該超過90%，密度控制在80%左右最佳

　　●對于無血清培養基，需要降低胰蛋白酶使用量。

　　以下細節一定要注意哦

　　（1） 移棄使用過的細胞培養基。

　　（2）使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA清洗細胞。在培養瓶背著細胞的一面加入清洗溶液，通過轉動培養瓶1到2分鐘清洗細胞層，然后去除清洗液。

　　（3）加入胰酶消化，消化細胞時，和操作手法，試劑的效價有密切的關系，消化時應注意觀察細胞形態，如細胞變得橢圓透亮，并且可以觀察到細胞與細胞間的間隙時，輕拍瓶身可以看見成流沙狀，即可中止消化，消化時盡量減少對細胞的吹打。

　　（4）當細胞完全分離時，垂直放置培養瓶，讓細胞流到培養瓶的底部。在培養瓶中加入完全培養基中止消化，計數并再次培養細胞。

　　（5）對于無血清培養基，加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1（v∶v）0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。