HILICMSVSIPRPLCMS：在DNA引物小核酸和mRNA加帽率分析應用

　　核酸是蛋白之外，生物制品領域另一重要分支。近年來，核酸藥物引起了公眾和研究單位極大的興趣。本文就DNA核酸引物、小 核酸和mRNA加帽的色譜質譜方法進行討論。 DNA引物是PCR測序的起始原料，其質量的優劣對PCR測定結果的影響較大。色譜法可實現DNA引物純度的初步評價，但無法分 離極性或結構類似的雜質，也無法對分子量進行確證。部分對引物質量控制較為重視的單位在本世紀初逐漸引入低分辨質譜，用 于引物分子量的確證。但低分辨質譜無法實現純度分析和序列準確分析。因此，超高分辨質譜（如Orbitrap）逐漸進入高端客戶 的實驗室，用于進一步提高DNA引物的質量評價。 相對于DNA引物，小核酸藥物對色譜、質譜分析方法的開發具有更大的需求。如果將小核酸與多肽藥物類比，兩者具有相似之 處，同時具有顯著差異。相似之處在于，兩種藥物均要求進行嚴格的雜質控制、分子量測定和序列表征。小核酸藥物和多肽藥物 中均具有大量結構相似和極性相近的雜質，對色譜分離造成極大的挑戰。不同之處在于，相比多肽藥物，小核酸的堿基數目更少 （4類堿基），需要獲得特異性更大的小核酸需要更長的序列或更獨特的修飾。由于特異性碎片更少，質譜確認雜質種類和結構 時，對一級的質量精確度和分辨率要求更高。此外，質譜分析中，核酸的二級斷裂方式比多肽藥物更多、豐度更低，對質譜的靈 敏度、二級質量準確度和軟件的自動匹配功能要求更高。 加帽率和加尾的分布是mRNA疫苗的關鍵質量屬性，影響疫苗的實際翻譯效率和穩定性。常規檢測方法無法區分mRNA的各種加 帽和未加帽形式。MS，尤其是基于Orbitrap技術的高分辨率、高選擇性和高靈敏度MS是解決該問題的唯一途徑。 受基質效應的影響，為了提高質譜檢測結果的準確性，尤其是定量結果的準確性，減少共同流出組分的干擾，需要適當的色譜分 離。相對于蛋白、多肽和大部分小分子化合物，核酸具有極性大、電負性強的特點，難以被常規反相作用色譜保留。揮發性離子 對-反相作用色譜（IP-RPLC）可增加核酸的保留，同時兼容MS的負離子檢測。但核酸分析的離子對試劑通常是極易電離的有機 胺類物質，該類物質在色譜和質譜系統中容易殘留，從而導致MS的正離子模式靈敏度降低甚至難以檢測。因此，使用IP-RPLC分 析核酸后的LC-MS系統需要經過徹底清洗，才可用于正離子模式的分析（多肽、蛋白和大部分小分子藥物）。長期使用IP-RPLC 分析核酸的LC-MS系統，即使徹底清洗仍難以恢復正離子模式原有的檢測靈敏度，因此該類實驗通常建議“專機專用”。尋找 IP-RPLC替代的分析方法，解決核酸的保留和質譜兼容性問題，一直受到研究者的關注，尤其是多肽藥物、蛋白藥物、小分子藥 物和核酸藥物均有涉及的實驗室。由于核酸具有高極性，部分研究者嘗試使用親水作用色譜（HILIC）分析核酸類物質。本文對比 了HILIC-MS和IP-RPLC-MS在小核酸、DNA探針和mRNA加帽分析中的應用，為讀者提供一些思路。

　　HILIC-MS與IP-RPLC-MS分析小核酸

　　相比IP-RPLC，HILIC在該小核酸的片段分析（fragmentation）中表現出更好的分離選擇性。在HILIC分析中，比主峰 更短的片段（fragments）均都在主峰前面出峰且呈現出較好的分離度。更好的分離度有助于提高含量較低組分在質譜中的響 應，增加該組分被鑒定的幾率。如表5所示，在HILIC-MS分析中，共鑒定到23個小核酸片段。由于Orbitrap的高靈敏度，即使 含量最低的片段1，仍能獲得較好的2級覆蓋，增加其鑒定的可靠性。同時由于Orbitrap的高靈敏度和HCD碎裂對大的 二級碎片的獲取能力，即使長度高達23堿基的長片段雜質也可獲得豐富的二級碎片，實現序列全覆蓋并提供可靠的序列鑒定 結果。

圖1 HILIC-MS和IP-RPLC-MS分析小核酸的TIC圖

　　HILIC-MS與IP-RPLC-MS分析DNA探針

　　 IP-RPLC和HILIC均可為目標探針提供較好的峰形和良好的質譜響應。由于Orbitrap的高靈敏度和HCD碎裂對不同長 度二級碎片的兼容性，兩種DNA探針均可實現全序列覆蓋。

　　Orbitrap出色的能力不僅體現在定性分析。由于Orbitrap在擁有高分辨率的同時，還能提供高靈敏度、寬線性范圍和高的質量 穩定性，Orbitrap還是出色的定量分析檢測器。我們用Orbitrap的PRM定量模式對DNA探針1進行定量分析，在上樣量低至5 pmol時仍然具有較高的響應和良好的線性，該靈敏度遠超Q-TOF分析。

　　HILIC-MS與IP-RPLC-MS分析mRNA加帽樣品

　　無論是一步法加帽還是兩步法加帽處理的樣品，在IP-RPLC-MS模式中，探針和mRNA5’端均可實現良好的分 離。因此，加帽樣品的檢測不受高濃度殘留探針的影響。在HILIC-MS模式中，由于探針和5’端樣品極性均較大且極性相似， 洗脫該組分所用流動相比例已接近HILIC色譜模式最低點[2]。無法通過優化梯度實現加帽樣品中的探針和mRNA5’端的分離。 受探針信號的抑制，部分在IP-RPLC-MS模式中可檢出的組分，在HILIC-MS模式無法去卷積得到。

　　結論 綜上所述，IP-RPLC-MS和HILIC-MS模式均可實現DNA探針和小核酸藥物的檢測。在一些小核酸和DNA探針的檢測中，HILICMS具有更好的分離選擇性、良好的靈敏度和線性。在mRNA加帽樣品的檢測中，仍然推薦IP-RPLC-MS分離檢測。DNA探針、 小核酸和mRNA的分離檢測對質譜要求較高，需要精確的一級質量數、豐富的二級碎片、高分辨率（7萬以上）用于排除假陽 性和對定量及定性結果的干擾。因此，無論是IP-RPLC模式還是HILIC模式分離，均推薦Orbitrap作為質量分析器，從而保障結 果的可靠性。