一把溫柔的“分子鉤針”，讓基因敲入不再“傷筋動骨”

在基因編輯的世界里，傳統的CRISPR-Cas9技術像一把力道剛猛的“分子剪刀”。它能精準地找到出錯的DNA序列，然后“咔嚓”一聲將其剪斷。但問題也隨之而來：這把剪刀在剪斷DNA雙鏈的同時，也常會引發細胞驚慌失措的“緊急修復”。這種修復往往是隨機的，可能導致意料之外的基因突變，甚至引發染色體易位，帶來安全隱患。

如何在不制造“傷口”的前提下，把正確的基因片段精準“寫入”基因組？這成了清華大學生命科學學院王海峰團隊一直思考的問題。

如果把傳統的雙鏈切割比作“傷筋動骨”的大手術，那么他們想要的，只是一把在DNA上挑開一個小缺口的“鉤針”，然后溫柔地將正確的基因片段“織”進去。

王海峰團隊開發的KNIT Editing系統（以下簡稱KE），就如同這樣一把溫柔的“分子鉤針”。該系統只需在DNA的一條鏈上制造一個切口，便能實現大片段基因的高效精準“織”入，效率最高可達89%，支持從0.7 kb（千堿基對）到超過10 kb DNA片段的可編程整合。7月22日，這項研究成果發表在《自然》上，有望為遺傳病治療和細胞療法提供更精準安全的工具，同時也打破了長期以來“僅基于單鏈切口的基因編輯效率低下”的傳統認知。

一次關于“時空”的跨界思考

王海峰的科研之路，并非一開始就直奔基因編輯而去。在博士和博士后階段，她更像一個癡迷于細胞內部動態的“觀察者”。“我特別想知道細胞里生命過程是如何發生的，比如染色質究竟如何運動，DNA互作又如何在時空維度上動態變化。”王海峰在接受《中國科學報》采訪時回憶道。

她開發的CRISPR LiveFISH技術給DNA帶上熒光，在活細胞里給染色質的運動和DNA互作拍“紀錄片”，并開發了CRISPR-GO技術調控染色質在細胞核內不同區室的定位。這種對染色質時空動態和三維基因組互作的理解，為她后來開發新工具埋下了伏筆。

“我們做活細胞成像時，學習到了‘時空’的概念。一件事要在正確的時間、正確的地點才能發生，一個分子也需要在正確的時空位置才能更好地發揮它的功能。”王海峰說。這種思路被巧妙地借鑒到了基因編輯中。傳統的雙鏈斷裂方法，是依靠細胞自身的修復機制去“補洞”，而這個“洞”補得是否精確，很難控制。

王海峰團隊意識到，想要實現安全精準的插入，關鍵或許不在于如何“破壞”，而在于如何“引導”。2022年左右，團隊進行了一項關鍵的系統性篩選。他們嘗試了各種方法：抑制其他DNA修復通路、融合DNA修復蛋白、DNA鏈上雙重切口……經過大量探索，一個看似簡單卻十分關鍵的策略最終脫穎而出——把修復模板“拉”到單鏈切口旁邊。

“我們發現，只要把供體DNA拉到足夠近的位置，單鏈切口就能非常有效地啟動修復和插入。”論文共同第一作者、清華大學生命科學學院博士后郜艷敏向《中國科學報》解釋道。

這個發現讓團隊感到驚喜。他們給這個技術起名為“KNIT Editing”，既寓意“編織”（knit）的過程，也對應其英文全稱 kilobase-scale nickase-targeting editing（千堿基尺度切口酶靶向編輯）。這個名字的靈感就來自織毛衣的動作——切口酶（nickase）如同一枚細小的鉤針，在DNA上形成精準的單鏈切口；而供體DNA則像一根毛線，在空間定位的引導下被牽引并“編織”進基因組，實現精準的基因信息寫入。

“很多工具開發的突破，最后看起來可能只是捅破了一層窗戶紙。但找到在哪里捅破這層窗戶紙，經常需要經歷長期的探索和反復嘗試。”王海峰說，“就這樣看起來很簡單的方法，我們找了四年才找到。”

不斷迭代：一場效率與安全的平衡術

團隊開發的KE系統的第一個版本KE1系統驗證了“供體空間鄰近性”是提升單鏈切口修復效率的關鍵。它能實現從0.7 kb到超過10 kb的大片段基因精準敲入，且非預期的插入缺失突變、染色體易位和脫靶編輯顯著低于傳統方法。

但王海峰團隊并不滿足于此。“能不能再提高一些效率？”在KE1的基礎上，他們開始了第二輪優化，嘗試了抑制其他DNA修復通路、融合DNA修復蛋白等，最終開發出優化的第二個版本KE2系統。

如果說KE1是一個鉤針，那么KE2就是一把“多鉤針”。“我們讓切口位點能招募更多的供體DNA。”王海峰比喻道，“就像以前勾一條線，現在勾一堆線過來，哪個能補上就用哪個。”這種略顯“粗暴”但有效的策略，進一步提高了供體DNA在切口附近的局部濃度，使得精準插入效率進一步提升，在某些位點比KE1系統提高1.5倍。

KNIT Editing策略示意圖及結果。

KE系統展現出幾項獨特優勢。首先，它支持重復編輯。由于單鏈切口幾乎不產生缺失突變，沒有完成插入的細胞依然保留完整的靶序列，可以接受多輪編輯，逐步提升編輯效率。

此外，它支持多位點同時編輯。王海峰提到，如果用傳統Cas9同時切割兩個染色體位點，“染色體易位的發生概率比較高，用活細胞成像都能直接看到”。研究團隊的數據表明，效率的提升并非以犧牲安全性為代價。恰恰相反，由于KE系統完全不產生DNA雙鏈斷裂，它從根本上規避了傳統技術最令人擔憂的風險。染色體易位幾乎檢測不到，脫靶效應同樣極低。

郜艷敏提到，這項成果最重要的價值在于安全性。她指出，傳統的CAR-T細胞制備常使用病毒載體實現CAR的隨機插入，存在引發繼發性腫瘤的潛在風險；而基于Cas9的雙鏈斷裂方法又會導致基因組不穩定。相比之下，KE系統提供了一種“無病毒、無斷裂”的精準整合方案，有望為提高細胞治療的安全性開辟新路徑。

表面上看，實驗順利推進，數據逐漸完備。但真正的硬仗，在投稿階段才開始。

2024年10月，團隊首次將論文投給《自然》雜志，第一輪收到了80多條審稿意見。審稿人認為文章有價值，但結果還比較初步。“那段時間確實很焦慮。”郜艷敏說，“一遍一遍地告訴自己，這個課題是有價值的。只要他們給了機會，就說明還有希望。”

團隊沒有被擊倒。他們花了數月補實驗，加強了應用部分的證據鏈，把文章中的數據做得更系統扎實，同時也投入大量精力重新調研文獻，打磨“創新性”的論述。針對審稿的每一條意見，研究團隊反復修改和打磨文章，并準備了100多頁的回復信。

第二輪投出后，一些審稿人提出了更多的問題，比如CAR-T編輯效率能否達到臨床應用水平。團隊再次扎進實驗室，連續幾個月，日復一日調整研究方案、優化系統，終于在2025年底拿到了理想的數據。

“王老師身上有種百折不撓的韌勁。”郜艷敏笑著回憶，“她一次一次鼓勵我們不要放棄，堅持做實驗、找問題、看文獻，我們經常聚在一起討論解決方案，互相打氣。事實證明，堅持一定會勝利。到第三輪投稿，審稿人給出了正向反饋。從投稿到接收，整整接近兩年。”

織補生命，帶來一線新曙光

工具的意義在于應用。為了驗證KE系統的臨床潛力，研究團隊在兩種具有挑戰性的場景中進行了測試。

第一種是遺傳病基因修復。

很多遺傳病都是因為單個基因突變導致的，但這個基因可能有多種不同的“出錯方式”。比如，有一種嚴重的免疫缺陷病（X-SCID），相關基因已經被發現了250多種不同的突變；還有一種叫溶酶體酸性脂肪酶缺乏癥（LAL-D）的病，它的相關基因也有100多種不同的突變。

面對這種“多種突變導致同一疾病”的復雜性，科學家希望開發一種“通用型”策略：把一段正常的基因拷貝放進細胞基因組的“安全位置”或內源基因位點，讓機體能夠長期、穩定地生產出需要的正確蛋白質，從而達到治療目的。研究團隊選取了含有溶酶體酸性脂肪酶缺乏癥相關LIPA基因突變的細胞模型，并利用KE系統成功地將正常的LIPA基因cDNA精準地插入了基因組的“安全港”位點（AAVS1），甚至在原位基因位點也進行了整合，有效恢復了蛋白表達。

第二種則是當下腫瘤免疫治療的熱門——CAR-T細胞療法。

CAR-T細胞療法，簡單說就是把患者自己血液里的免疫T細胞抽出來，在實驗室里給它們裝上專門識別癌細胞的CAR“導航系統”，再輸回體內，讓這些被“武裝”過的CAR-T細胞去識別追殺腫瘤。目前主要用于血液系統惡性腫瘤的治療，為許多傳統治療無效的患者帶來了臨床治愈的可能。

然而，傳統的CAR-T制備依賴病毒載體將CAR隨機整合入T細胞基因組，存在不確定性，美國FDA和歐洲EMA都曾就此發出過安全性警示；新近的研究用基因編輯在特定基因定點敲入CAR，但現有方法涉及雙鏈斷裂，可能引發基因組不穩定性。研究團隊采用的KE系統在精準編輯方面展現了獨特的優勢。研究團隊在臨床相關的TRAC位點實現了CAR基因的高效精準整合，平均效率約32%，最高達40.6%，同時顯著降低了染色體易位和脫靶整合的風險。“這樣制備出的CAR-T細胞，保持了很好的活性和增殖能力，在體內外都展現出了有效的腫瘤殺傷效果。”王海峰介紹。

KNIT Editing技術優勢及應用前景。

這一過程中，研究團隊學習了很多國內外同行的前沿方法，尤其從國內優秀團隊的工作中獲益良多。在編輯精度檢測方面，團隊學習了北京大學胡家志團隊建立的評估體系；在定點整合制備CAR-T和基因編輯技術應用領域，則重點學習了浙江大學黃河團隊、華東師范大學劉明耀團隊、杜冰團隊與李大力團隊、中國科學院高彩霞團隊，以及武漢大學張楹團隊與殷昊團隊等國內高水平研究團隊的杰出工作與系列研究。

對此，郜艷敏感觸頗深。她說：“在做CAR-T細胞編輯時，我們一開始并不知道多高的效率才有臨床意義。后來學習到國內專家的工作，發現大約20%的插入效率在臨床達到了治療效果，這給了我們一個清晰的目標。”正是基于對國內外優秀團隊工作的學習與對標，他們不斷優化系統，最終實現目標。

從一次偶然的發現，到一個原創工具的誕生，再到具有臨床前景的應用嘗試，王海峰團隊走了整整四年。其間經歷了多輪系統優化和修改打磨，寫了總共長達200多頁的審稿回復，但團隊頂住壓力最終堅持了下來。

“我希望我們的工具能夠真正發揮作用。”王海峰說。懷揣著對解決真正科學問題的渴望，這個年輕的團隊不斷前行。他們用一把溫柔的“分子鉤針”，在基因組的“天書”上，繡出了一幅安全與高效并重的未來圖景，期望為那些曾被視作不治之癥的遺傳病和腫瘤患者，增加一線新的曙光。和很多基因編輯工具一樣，KE系統的應用也會受到遞送系統的限制。此外，依賴單鏈切口介導同源重組修復（HDR）的分子機制仍需要進一步解析。

團隊下一步的方向，是進一步優化遞送系統、探索招募模塊的迭代，以及研究單鏈切口介導HDR的分子機理。“專業的事還需要專業的人去做。”王海峰說，“我們希望能與更多領域的專家開展合作，也期待有相關背景的人才加入團隊，探索這一系統在疾病研究和精準醫學應用中的潛力。”

（文中圖片皆為課題組提供）

相關論文信息：https://doi.org/10.1038/s41586-026-10819-7