上海生科院構建細胞核內長非編碼RNA的新型表達載體

　　 11月5日，國際學術期刊Nucleic Acids Research在線發表了中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所陳玲玲研究組關于研究細胞核內長非編碼RNA的新型表達載體。該研究首次構建了一種可以將外源過表達的RNA滯留在細胞核內的載體（snoVector），而且過表達的RNA具有生物學功能。

　　長非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA），一般是指長度大于200個核苷酸，但是不具有編碼功能蛋白質能力的長鏈RNA分子。已有很多研究表明，lncRNAs廣泛參與一系列的基因表達調控和生物學過程。有意思的是，許多lncRNAs所介導的調控是發生在細胞核內的，因此需要新的工具來研究其在細胞核內的功能。

　　如同研究編碼基因一樣，lncRNA也需要通過質粒載體將其在細胞內進行過表達來研究。然而，目前已知的真核表達載體多數是用來表達編碼基因的，載體上含有轉錄元件、翻譯元件和一些促進核質運輸（細胞核和細胞漿運輸）的元件。因此，這些載體上的轉錄本就會按照mRNA的加工方式進行加工，并且運到細胞漿里。使用這些載體外源表達一些僅定位在細胞核中的lncRNAs時，這些RNA經常會被運到胞漿里，從而阻礙了其功能的正常發揮，導致出現錯誤的實驗結果。

　　因此，針對上述現有技術中所存在的問題，同時基于實驗室近期發現的一類新型的lncRNA，sno-lncRNA（不含5’帽子和3’尾巴，兩端以snoRNA結尾，滯留在細胞核中，Yin et al., Mol Cell, 2012），研究人員設計并構建了一種可以把外源的RNA滯留在細胞核內的表達載體，即snoVector。該載體是由pZW1載體（Wang et al., Cell 2014）改造而來。pZW1載體中的EGFP基因被一個含有多克隆位點的內含子分成兩部分，只有當內含子被剪接下來后，才能形成成熟的egfp mRNA，并產生綠色熒光蛋白。研究組在pZW1載體序列多克隆位點中插入兩個snoRNA基因，并保留多個酶切位點，便于插入要表達的外源RNA（如圖）。當該質粒轉染細胞時，含有外源RNA序列的sno-lncRNA能夠被表達，通過觀察EGFP的產生可以監測sno-lncRNA的加工。

　　研究組以細胞核內定位的lncRNA，如NEAT1、HOTAIR為研究對象，成功地提高了它們在細胞核的定位。重要的是，研究人員還證明以這種載體表達的兩端以snoRNA結尾的NEAT1可以模擬其內源RNA的功能，并發揮生物學作用。研究還證明該snoVector載體可以很有效地表達幾乎任何長度在3kb以內的RNA，并使其滯留在細胞核內。例如該載體可以將原本定位于胞漿中mRNAs，如SNRPN、CEBPA等表達并滯留在細胞核內；一些通常被快速降解的內含子序列也能被穩定地表達并滯留在細胞核中；另外，該載體也可以用于表達miRNAs。此外，該載體能夠產生綠色熒光蛋白，并含有抗性基因，可以用于穩定表達株的篩選。

　　SnoVector用于過表達外源RNA并將其滯留在細胞核中，提供了一種新型的表達載體用于研究細胞核內的lncRNAs。該載體的應用將方便人們對細胞核內RNA的功能和機制的研究，為lncRNA的研究提供新的研究手段。

　　本課題在陳玲玲研究員指導下，主要由博士研究生殷慶飛和胡世斌完成，工作人員徐葉芬、中國科學院—馬普學會計算生物學伙伴研究所楊力研究員和美國康涅狄格大學Gordon Carmichael教授也參與了該工作。該研究得到了中科院、國家自然科學基金委、科技部和上海生科院的經費支持。

在pZW1載體序列多克隆位點中插入兩個snoRNA基因，并保留多個酶切位點